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可溶性程序性死亡配体 1 对 T 淋巴细胞功能的影响及其机制 中文摘要协同刺激信号在 T 淋巴细胞参与的免疫应答过程不同阶段发挥重要的调控作用。 程序性死亡受体 1（Programmed death-1，PD-1）是 B7 家族成员之一，而程序性死亡 配体 1（Programmed death ligand-1，PD-L1）为协同刺激分子 PD-1 的配体之一。PD-1 主要表达于活化的 T、B、单核细胞表面。PD-1/PD-L1 介导的负性抑制信号可通过抑 制 T、B 淋巴细胞功能参与多种疾病的发生、发展。研究发现，许多协同刺激分子除 以细胞膜型外，还有可溶性形式存在，如 CD28、CTLA-4（细胞毒 T 淋巴细胞相关 抗原-4）、CD80、CD86、B7-H3 和 B7-H4 等，这些可溶性因子的生物学意义及与临 床疾病的相关性尚待研究。通过研究 PD-1/sPD-L1 途径对 T 淋巴细胞功能的影响，并 阐明其作用机理，有望为人类疾病的免疫治疗提供新策略。本研究通过观察不同浓度 sPD-L1 对人 T 淋巴细胞功能的影响及 PD-1 胞浆区信 号接头分子酪氨酸蛋白酶（SHP）-1、SHP-2 及磷酸化 SHP-1（ p-SHP-1）、p-SHP-2 的改变，并分析其生物学意义，揭示 PD-1/sPD-L1 协同刺激信号对 T 淋巴细胞的抑制 机理，进一步探究 sPD-L1 如何起负性调控作用。一、可溶性 PD-L1 通过 PD-1/sPD-L1 途径抑制 T 淋巴细胞功能【目的】 分析 sPD-L1 对 T 淋巴细胞增殖、周期、凋亡的影响。【方法】 应用流式细胞术测定健康人外周血 T 淋巴细胞膜表面活化前后的 PD-1 分子的表达，应用 CCK-8 法体外研究不同浓度 sPD-L1 对 T 淋巴细胞增殖的影响，确 定抑制 T 淋巴细胞增殖的最低浓度，并流式细胞术测定此浓度 sPD-L1 对 T 淋巴细胞 周期及凋亡的影响。【结果】 健康人外周血 T 淋巴细胞低表达 PD-1，活化的 T 淋巴细胞表面则高表中文摘要 可溶性程序性死亡配体 1 对 T 淋巴细胞功能的影响及其机制 达 PD-1，可溶性 PD-L1 蛋白（sPD-L1Ig）工作浓度为 250 ng/ml 时能通过 PD-1/sPD-L1 途径抑制 T 淋巴细胞的增殖（P=0.017），低于此浓度的 sPD-L1Ig 均未能引起 T 淋巴 细胞增殖的抑制（P0.05），特异性阻断 PD-1/sPD-L1 抑制信号可部分恢复 T 淋巴细 胞的增殖活性（P=0.035）；sPD-L1Ig 促使细胞周期 G1 期 T 淋巴细胞百分比明显增高（P=0.000），特异性阻断该抑制信号可降低 G1 期 T 淋巴细胞百分比（P=0.014）；sPD-L1 使 T 淋巴细胞凋亡率明显增高（P=0.001），加入阻断剂后可部分逆转 T 淋巴细胞的 凋亡率（P=0.002）。【结论】 可溶性 PD-L1 可通过 PD-1/sPD-L1 途径抑制活化 T 淋巴细胞的增殖， 促使细胞周期停滞在 G1 期，促进其凋亡，sPD-L1 表达的增高，可能与细胞免疫调节 作用相关。二、PD-1/sPD-L1 信号通路接头分子 SHP-1、SHP-2 在对 T 淋巴细胞 功能抑制作用中的意义【目的】检测不同年龄段健康人血清中 sPD-L1 表达水平及 sPD-L1 作用下 PD-1 接头分子蛋白酪氨酸磷酸酶（SHP）-1 和 SHP-2 的募集量，探讨 sPD-L1 激发 PD-L1/sPD-1 信号通路抑制信号的机制。【方法】 选取 2013 年 6 月至 2014 年 5 月于苏州大学附属第二医院体检中心健 康志愿者 108 例，采用酶联免疫吸附方法检测 20-30 岁，31-50 岁，51-70 岁年龄组人 群血清中 sPD-L1 表达水平。免疫磁珠法分离健康人外周血 T 淋巴细胞，将细胞分为 5 组：A 组：静止 T 淋巴细胞组、B 组：活化 T 淋巴细胞组、C 组：活化 T 淋巴细胞+sPD-L1Ig 组、D 组：活化 T 淋巴细胞+sPD-L1Ig+mIgG 组、E 组：活化 T 淋巴细胞+sPD-L1Ig+2H11 组。免疫沉淀法沉积 PD-1 接头分子 SHP-1 和 SHP-2，Western 印迹 法检测各组细胞 SHP-1，p-SHP-1，SHP-2，p-SHP-2 分子表达量。【结果】健康人外周血中存在 sPD-L1 分子表达，20-30 岁年龄组的表达水平 最低，其浓度约为（0.766±0.154）ng/ml，31-50 岁组表达水平为（0.866±0.201）ng/ml， 51-70 岁年龄组则具有更高表达水平（1.047±0.453）ng/ml。20-30 岁组与