快速老化小鼠耳蜗ngf的表达分布和增龄性变化 以及pcdna3-expression distribution and aging change of ngf in cochlea of rapidly aged mice and pc dna 3.docxVIP

PAGE PAGE 10 快速老化小鼠耳蜗 NGF 的表达分布和增龄性 变化、以及 pcDNA3-β-NGF 的构建 中 文 摘 要 目的：研究神经生长因子（nerve growth factor, NGF）在小鼠耳 蜗中的表达分布、以及年龄相关性变化特点，构建真核表达载体 pcDNA3-β-NGF，为老年性耳聋的 NGF 基因治疗提供支持。方法： 选取 5、7 月龄的快速老化小鼠亚系 8 (S en es ce n c e acc el e ra t ed d e me n t i a mo u s e/ p r o n e , SAMP8)作为实验组，而同龄抗快速老化小 鼠亚系 1 (S en e s c en ce ac c el e r at ed mo u s e/ r es i s t a n c e 1 , SAMR1) 作为 SAMP8 的正常对照组；应用免疫组织化学染色方法分别观察其 耳蜗中神经生长因子（NGF）的表达分布情况、以及增龄性变化特点。 取胎脑组织 50g，提取 RNA，经 RT-PCR、XhoI 和 HindIII 双酶切及 T4 连接酶连接构建真核表达载体 pcDNA3-β-NGF。结果：1、NGF 在小鼠耳蜗的表达分布、以年龄相关性变化特点：在小鼠耳蜗中，神 经生长因子在螺旋神经节细胞、内外毛细胞、听神经纤维及血管纹中 均有表达，且螺旋神经节细胞、以及内外毛细胞为主要表达部位。耳 蜗螺旋神经节细胞、以及内外毛细胞 NGF 免疫组化染色平均光密度 值：耳蜗 NGF 免疫组化染色图象分析，与对照组比较，第 5、7 月龄 SAMP8 小鼠耳蜗螺旋神经节细胞、以及毛细胞中的 NGF 蛋白表达较 同龄 SAMR1 小鼠明显降低（P＜0.05）；各 组 小 鼠 耳蜗 螺 旋 神 经 节 细 胞 N GF 免 疫 组 化 染 色 平 均 光 密 度 值 分 别 为 ：5 月 龄 实 验组 S A M P8 小 鼠 ： 0.281±0.005，5 月龄对照组 SAMR1 小鼠： 0.420±0.039，7 月 龄 实 验组 S AM P8 小 鼠 ： 0.220±0.008，7 月龄 对照组 SAMR1 小鼠：0.342±0.017。7 月龄 SAMP8 与 5 月龄 SAMP8 进行组内比较 P＜0.01；7 月龄 SAMP8 与 7 月龄 SAMR1 进行组间比 较 p＜0.01；5 月龄 SAMP8 与 5 月龄 SAMR1 进行组间比较 P＜0.01 有显著性差异。 各组小鼠耳蜗毛细胞 NGF 免疫组化染色平均光密度 值 分 别 为 ： 5 月 龄 实 验 组 S A M P8 小鼠： 0.291±0.007，5 月龄 对照组 SAMR1 小鼠：0.410±0.011，7 月 龄 实 验 组 S A MP8 小鼠： 0.213±0.009，7 月龄对照组 SAMR1 小鼠：0.334±0.012。7 月龄 SAMP8 与 5 月龄 SAMP8 进行组内比较 P＜0.01；7 月龄 SAMP8 与 7 月龄 SAMR1 进行组间比较 P＜0.01；5 月龄 SAMP8 与 5 月龄 SAMR1 进 行组间比较 P＜0.01 有显著性差异。 2、真核表达载体 pcDNA3-β-NGF 的构建：人 β-NGF 与质粒载体 pcDNA3 连接后的重组质粒、经双酶切鉴定、以及序列检测后证实与 人 β-NGF 序列完全相符。 结论：NGF 蛋白在小鼠耳蜗中广泛表达， 并且其表达水平随着小鼠年龄增长而降低，说明 NGF 基因可能与维 持耳蜗的功能状态有关。人 β-NGF 与质粒载体 pcDNA3 连接后符合 人 NGF 基因序列，可以为在 NGF 基因水平展开老年性耳聋的防治实 验研究提供支持。 关键词：神经生长因子；螺旋神经节细胞；毛细胞；快速老化 小鼠；真核表达载体 Distribution and age-related changes of nerve growth factor in the cochlea of mouse, construction of eukaryotic expression plasmid for NGF gene ABSTRACT Objective: Investigate the distribution and the age-related of NGF changes in the cochlea of mouse and construct eukaryotic expression plasmid for NGF gene to provide support to NGF gene therapy on presbycusis. Metho