丽江大黄中四种成分对小鼠颅顶前成骨细胞mc3t3-effects of four components in rheum lijiang on mc 3t3 cells in mouse cranial fossa.docxVIP

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2018-05-29 发布于上海
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丽江大黄中四种成分对小鼠颅顶前成骨细胞mc3t3-effects of four components in rheum lijiang on mc 3t3 cells in mouse cranial fossa.docx

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丽江大黄中四种成分对小鼠颅顶前成骨细胞mc3t3-effects of four components in rheum lijiang on mc 3t3 cells in mouse cranial fossa

摘要最近研究发现大黄具有抗骨质疏松的作用，丽江大黄作为中药大黄的一种，其含有很多活性成分。成骨细胞在骨质疏松中起着至关重要的作用，MC3T3-El细胞系是一个能够代表成骨细胞分化的经典模型，常用来做体外药物筛选研究。本论文通过实验探讨丽江大黄中的几种成分对MC3T3-E1细胞分化过程中的影响及可能机制，从而为其在骨质疏松方面的研究提供理论基础与依据。本研究分为两个部分：第一部分建立小鼠颅顶前成骨细胞MC3T3-E1分化模型，对每一阶段特异性指标进行检测以确定MC3T3-E1细胞诱导成功；第二部分研究中药丽江大黄中4种活性物质脱氧土大黄苷、大黄素、芦荟大黄素和RDET(含有几种单体的混合物)对小鼠颅顶前成骨细胞MC3T3-E1增殖与分化的影响。选取2种诱导液：诱导液Ⅰ(抗坏血酸50μg/ml、β-甘油磷酸钠10mmol/l)与诱导液Ⅱ(抗坏血酸50μg/ml、β-甘油磷酸钠10mmol/l、地塞米松10-8mol/l)；采用碱性磷酸酶（ALP）染色法、茜素红染色法选取最佳诱导液Ⅱ，再通过免疫组化法检测骨钙素含量、冯库萨染色检测钙结节等确定诱导建立模型成功；小鼠颅顶前成骨细胞MC3T3-E1，在诱导液Ⅱ诱导分化的作用下，分化为成骨细胞，采用噻唑蓝(MTT)法检测几种活性成分对分化后的MC3T3-E1细胞增殖作用；检测碱性磷酸酶(ALP)的表达以及其活性；茜素红染色法和冯库萨染色法检测钙化结节；免疫组化法检测骨钙素含量；采用RT-PCR检测活性成分对OPG/RNNKL表达的影响。通过染色结果确定诱导液Ⅱ与诱导液Ⅰ均能将MC3T3-E1诱导成成骨细胞，但诱导液Ⅱ的效果更佳，因此选取诱导液Ⅱ为诱导液。MTT结果显示脱氧土大黄苷在10μg/ml以上对MC3T3-E1细胞有促进增殖的影响。RDET与大黄素在40μg/ml以上对MC3T3-E1细胞有促进增殖的作用、芦荟大黄素没有明显的促进增殖影响。ALP染色结果显示脱氧土大黄苷、芦荟大黄素、RDET在10μg/ml作用浓度下提高ALP活性，大黄素没有明显的作用；而ALP酶活性测定显示RDET与模型组相差不大。脱氧土大黄苷与RDET可以促进骨钙素减少。茜素红染色与冯库萨染色结果为：芦荟大黄素与大黄素作用的细胞所产生的矿结节较多，但大黄素作用的细胞形态发生较大的改变。分化早期与中期活性成分对MC3T3-E1细胞中OPG的增多没有明显的I效果，晚期会发现RDET促进了OPG数量的增加。诱导液Ⅱ(抗坏血酸50μg/ml、β-甘油磷酸钠10mml/l、地塞米松10-8mol/l)能更好的诱导MC3T3-E1细胞向成熟的成骨细胞分化；脱氧土大黄苷、RDET、大黄素能促进MC3T3-E1细胞增殖；在MC3T3-E1细胞向成熟的成骨细胞分化过程中：脱氧土大黄苷与RDET可以促进骨钙素减少，芦荟大黄素与大黄素则促进细胞矿结节的增多，分化晚期，RDET促进OPG含量的增加。关键词：丽江大黄；小鼠颅顶前成骨细胞MC3T3-E1；增殖与分化；碱性磷酸酶；OPG/RANKLIIAbstractRecentstudieshavefoundthatrhubarbcantreatosteoporosis.RheumlikiangenseisakindoftraditionalChinesemedicinewhichcontainsalotofingredients.Osteoblastsplayavitalroleduringdevelopmentofosteoporosis,MC3T3-Elcelllineisaclassicalmodelwhichcanrepresenttheosteoblastdifferentiationandhasbeenwidelyusedinvitro.Inthisstudy,weaimedtoexplorewhatingredientscantreatosteoporosisandprobethemechanismofaction,whichcouldprovidetheoreticalfoundationandbasistoseekforthetreatmentofosteoporosisinthetraditionalChinesemedicineeffectivecompounds.Thisexperimentisdividedintotwoparts,thefirstpartaimstoscreenouttheinducerwhichcaninducethemiceparietalosteoblastMC3T3-E1differentiationtomatureosteoblasts,andtotestspecificindicatorsofeachstagetomakesuret