食品安全与检测课件 荧光PCR技术知识-肖性龙.pptx

荧光PCR技术肖性龙PCR技术-DNAPCR技术-发明人Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法…...PCR技术-发明经过Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA， ……PCR技术-发展历程Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1983年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术。 1989年美国《Science》杂志列PCR 为十余项重大科学发明之首,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。123高温变性低温退火适温延伸94温度（℃）72552212345时间（min）PCR技术-反应条件重复1~3步25~30轮DNA变性形成2条单链目的DNA片段扩增100万倍以上子链延伸DNA加倍DNA单链与引物复性DNA双螺旋理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 PCR技术-反应产物PCR技术-结果分析对终产物进行分析荧光PCR技术-定义定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线和CT值对未知模板进行定量分析的方法。对样本初始浓度进行定量分析荧光PCR技术-荧光信号种类荧光染料直接结合扩增产物 荧光标记引物特异性荧光探针荧光PCR技术-荧光基团荧光PCR技术-荧光信号的产生荧光标记基团在某波长的激发光刺激下，产生一个更长波长的发射光.荧光PCR技术-荧光共振能量转移 FRET，fluorescence resonance energy transfer当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光基团，这个过程称为荧光共振能量转移(FRET),实际相当于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团（供体）的发射光谱与另一基团（受体）的激发光谱有一定的重叠，当两个基团之间的距离足够近（小于100?）时，以供体基团的激发波长进行激发，可获得由受体基团发射的荧光。荧光PCR技术-荧光共振能量转移荧光PCR技术-荧光染料SYBR GREEN I荧光PCR技术-SGI熔解曲线荧光强度Vs温度荧光强度的变化是由于温度不断升高双链DNA解离，SGI重新游离到溶液中Tm是熔解曲线的特征值荧光PCR技术-SGI熔解曲线以荧光值随温度变化作负导优化的读板温度 - 高于非特异产物的Tm值 - 低于目标产物的Tm值荧光PCR技术- Taqman探针特异性荧光双标记探针Taq酶 5’→3’外切酶活性荧光PCR技术-MGB探针Taqman-MGB (Minor Groove Binder)荧光PCR技术-分子信标探针荧光PCR技术-杂交探针荧光PCR技术-杂交探针荧光PCR技术-置换探针荧光PCR技术- 通用UT探针荧光PCR技术- Scorpions? 探针荧光PCR技术- Scorpions? 探针荧光PCR技术- Amplifluor 引物探针荧光PCR技术- Amplifluor 引物探针荧光PCR技术-Light up探针荧光PCR技术- 荧光淬灭效率FRET与接触淬灭的比较荧光PCR技术-常用荧光基团荧光PCR技术-Taqman技术原理每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光荧光PCR技术-Taqman技术原理荧光PCR技术-典型的荧光曲线荧光PCR技术-荧光阈值定义：前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值荧光域值的缺省设置是3—15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。荧光PCR技术-荧光阈值标准曲线法 斜率的绝对值接近3.322R2接近1较好的区分样品重复 平行样的Ct值之间的差0.5荧光PCR技术-荧光阈值C(t) value 荧光PCR技术-结果分析Ct值（Cycle threshold ） PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数.PCR扩增过程中，扩增产物荧光信号超过基线值（进入指数增长期）时的循环数.荧光PCR技术-重复性 相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图 终点处检测产物量不恒定；Ct值则