il-20启动子区多态性在与感染相关银屑病中的功能研究-study on the function of il - 20 promoter polymorphism in psoriasis associated with infection.docxVIP

名称引物序列IL-20PromotersenseP15-GGGGTACCATCACTTGCTCTGTGCTAAGT-3IL-20promoteranti-senseP25-GAAGATCTTAGAGGCTTTCATCTTAGGC-3IL-20定点突变senseP35-ATTCCAGTTTACCCAGCACTGAGGTTGGGGGGC-3IL-20定点突变anti-senseP45-GCCCCCCAACCTCAGTGCTGGGTAAACTGGAAT-3IL-20real-timesenseP55-GCCAATTCCTTTClTACCATCAA-3IL-20real-timeanti-senseP65-CCCACAATGGCATGTCATGT-3CpG-B5-tcgtcgttttgtcgttttgtcgtt-3小写碱基由硫代修饰。1.5人永生化角质形成细胞HaCaT细胞株购自中国典藏物保藏中心。HEK293t细胞株（人胚胎肾细胞株）由上海瑞金医院内分泌实验室惠赠。2方法2.1构建人IL-20启动子区的荧光素酶报告基因2.1.1人IL-20启动子区DNA的合成（1）引物设计根据网上公布的IL-20上游2000bp序列，使用Primer3软件设计引物，分别在引物的5端加上限制性内切酶Kpn-I和Bgl-II的酶切位点，上游引物P1为5’-GGGGTAC^CATCACTTGCTCTGTGCTAAGT-3(含Kpn-I酶切位点)，下游引物P2为5’-GAAGATC^TTAGAGGCTTTCATCTTAGGC-3(含Bgl-II酶切位点)。根据该引物可以从人DNA库中扩增全长为2000bp的IL-20启动子区DNA（-105445bp）。（2）人IL-20启动子区DNA序列的获得以人外周血单个核细胞DNA为模板，P1、P2为引物，PCR扩展人IL-20启动子区DNA序列。25ul反应体系做PCR反应：2*buffer12.5μldNTPs（浓度4umol/ul）2μl上下游引物各（浓度2umol/ul）5μl模板（浓度200ng/ul）0.1μlLataq酶0.25μlddH2O0.15μl反应条件：95℃预变性3min94℃变性1min58℃复性1min35cycle72℃延伸2min72℃再延伸10min取上述PCR产物溴化乙锭染色后，于1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，100V，30min后紫外灯下观察。可见相应特异条带符合目的基因片段长度，从凝胶中回收PCR产物。（3）PCR产物割胶回收在紫外灯下用干净锋利的刀片切下琼脂糖凝胶中的目的DNA片段；把切下的胶条放入一个新的Eppendorf管并称重，加入3倍体积的BufferQG；50℃温浴10分钟使凝胶完全溶解；将一个QLAquick柱子放入一个2ml收集管；把带有DNA样品的液体转入柱子，13000rpm离心1分钟；弃收集管中的液体，并把柱子放回原处；加入0.75mlBufferPE洗涤，13000rpm离心1分钟；弃收集管中的液体，再13000rpm离心1分钟；将柱子置于一个新的1.5mlEpperndorf管，加入50ulddH2O或BufferEB13000rpm离心1分钟。2.1.2目的DNA片段的亚克隆（1）PCR扩展产物和质粒用Kpn-、Pgl-双酶切，割胶纯化，回收目的片段。目的片段与载体的链接按所需克隆DNA片段于载体的摩尔比为3:1，计算所需目的片段的量，建立连接体系：新鲜纯化的PCR产物3μlT-easyvector1μl2*buffer5μl去离子水0μlT4DNA连接酶1μl总体积10ul，轻轻混合均匀，4℃冰箱过夜连接。（2）感受态细胞转化取5ul连接产物，加入200ul感受态细胞，冰浴30min，然后42℃热休克90sec，立即置于冰上2min，加入LB0.8ml，37℃恒温摇床1h。结束后，取两块浓度为100ug/ml氨苄青霉素、X-gal以及IPTG的LB培养箱，分别取上述菌液200ul铺板，倒置于37℃恒温培养箱过夜。（3）阳性克隆的挑选：用灭菌牙签在每块培养板上挑选2个白色单菌落，接种到含100ug/ml氨苄青霉素的3mlLB培养液中，于37℃恒温摇床250rpm中震荡培养过夜。（4）小规模质粒DNA抽提菌液4ml，4000rpm离心2min弃上清，将离心管倒置于吸水纸上以弃去剩余液体加入100ulsolutinI（细菌重悬液），剧烈震荡加入200ulsolutinII（细菌裂解液），立即上下颠倒几次，室温2min加入400ulsolutinIII，立即上下颠倒5-10次，室温2min13000rpm离心15min将上清液全部转移到套有2ml样品收集管的3s柱子里，室温2min12000rpm离心1min弃去流出液，加入700ulwashsoluti