jak2stat3信号通路对非小细胞肺癌血管生成影响的研究-effects of jak 2 stat 3 signal pathway on angiogenesis in non-small cell lung cancer.docxVIP

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2018-05-27 发布于上海
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jak2stat3信号通路对非小细胞肺癌血管生成影响的研究-effects of jak 2 stat 3 signal pathway on angiogenesis in non-small cell lung cancer

第一部分非小细胞肺癌组织中 JAK2/STAT3 信号通路相关分子的表达与血管生成关系的研究JAK2/STAT3信号通路在多种肿瘤组织和细胞系中持续激活和异常表达，能够促进肿瘤的增殖、侵袭、血管生成和转移。目前NSCLC中关于JAK2/STAT3通路与MVD 值之间关系的研究较少。因此有必要检测肺癌组织中JAK2/STAT3信号通路中JAK2， STAT3以及它们的活化形式pJAK2 , pSTAT3，及微血管密度的表达情况，并分析统计其与临床资料各参数的关系以及与生存期预后的相关性，以明确 NSCLC 中 JAK2/STAT3通路的活化情况，以及该通路对血管生成的影响，为下一步实验提供研究线索和实验基础。材料和方法1材料1.1材料收集我院2004年3月至2006年12月间收治的NSCLC患者术后石蜡包埋病理切片68例，所有患者术前均未行放化疗和生物免疫治疗，术后诊断经病理证实。并收集17例尸检非瘤标本与7例手术切除炎性假瘤及3例肺大疱共计27例正常肺组织的石蜡切片进行对照。所有患者经医院伦理委员会同意并签署知情同意书。1.2 试剂与耗材JAK2 Rabbit mAbCell Signaling Technology 公司, 美国Phospho-JAK2 Rabbit mAbAbcam 公司, 英国STAT3 Rabbit mAbCell Signaling Technology 公司, 美国Phospho-STAT3Rabbit mAbCell Signaling Technology 公司, 美国VEGF mouse mAbSanta Cruz Biotechnology 公司, 美国bFGF rabbit polyclonal antibody Abcam, 英国CD34 一抗DAKO 公司, 丹麦Envison 试剂即用型二抗DAKO 公司, 丹麦(9) 免疫组织化学试剂盒武汉博士德公司(10)DAB 显色试剂盒福建迈新生物技术有限公司(11)PBS 磷酸盐缓冲液福建迈新生物技术有限公司(12)0.9%生理盐水注射液上海百特医疗药品有限公司1.3 仪器设备(1) 2145型石蜡标本切片机德国Leica公司(2) ASP300组织脱水机德国Leica公司(3) 上菱BCD-230钾D冰箱上海上菱冰箱制造厂(4) 微波炉广东格兰仕电子有限公司(5) 普通显微镜日本奥林巴斯株式会社(6) 恒温孵育箱DHP120上海实验仪器有限公司(7) 10ul 、200ul、1000ul吸头美国Axygen公司Fluor-S MultiImager多功能图像分析仪美国Bio-Rad公司组织阵列仪美国Beecher lnstruments公司(10)载玻片德国MenzeI Glaser公司(11)孵育盒BOX-0O01福建迈新生物技术有限公司(12)可调微量移液器福建迈新生物技术有限公司(13)冲洗瓶福建迈新生物技术有限公司(14)定时器福建迈新生物技术有限公司2 方法2.1 组织芯片的制备组织芯片由本院病理科完成设计和制备。 2 .2 HE染色(1)二甲苯(Ⅰ)5-10 min(2) 二甲苯(Ⅱ)5-10 min(3) 95%乙醇(Ⅰ)1-3 min(4)95%乙醇(Ⅱ)1-3 min(5)80%乙醇1 min(6)蒸馏水1 min(7)苏木精液染色5-15 min(8) 流水稍洗去苏木精液1-3 s(9) 1%盐酸乙醇1-3 s(10) 稍水洗10-30 s(11)促蓝液返蓝10-30 s(12) 流水冲洗10-15 min(13)蒸馏水过洗1-2 s(14) 0.5%曙红液染色1-3 min(15) 蒸馏水稍洗1-2 s(16) 80%乙醇稍洗1-2 s(17) 95%乙醇(Ⅰ)3-5min(18) 95%乙醇(Ⅱ)3-5 min(19) 无水乙醇5-10 min(20) 无水乙醇5-10 min(21) 烘干、中性树胶封片，显微镜下观察2.3免疫组化染色(1)切片脱蜡。(2)缓冲液洗 3min/2 次。(3) 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色 , 将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟。(4) 缓冲液洗 5min/2 次。(5) 滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1-2 小时。(6) 缓冲液洗 5min/2 次。(7)滴加 HRP Polymer( 酶标二抗 ) ，在室温下孵育 30 分钟。(8)缓冲液洗 5min/2 次。(9)向 1ml DAB Plus Substrate中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen, 混匀后滴加到切片上，孵育 3 -15 分钟。(10)自来水充分冲洗 , 复染，脱水