拟南芥LRR-RLK家族蛋白CLV1胞外域可溶性表达与纯化.docVIP

拟南芥LRR-RLK家族蛋白CLV1胞外域可溶性表达与纯化 　　摘要：大肠杆菌ＮｕｓＡ蛋白与拟南芥ＬＲＲ－ＲＬＫ家族蛋白ＣＬＡＶＡＴＡ１（ＣＬＶ１）胞外结构域（Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ， ＥＣＤ）融合表达，实现了蛋白ＣＬＶ１－ＥＣＤ的可溶性表达；ＣＬＶ１-ECD与其配体蛋白ＣＬＡＶＡＴＡ３（ＣＬＶ３）共表达，可以明显提高它的水溶性。该实验方法快速简易地获得了大量纯化的ＣＬＶ１－ＥＣＤ蛋白，避免了包涵体变性与复性的复杂过程，为植物ＣＬＡＶＡＴＡ信号系统的进一步研究奠定了基础。 　　关键词：亮氨酸重复序列；ＣＬＡＶＡＴＡ１（ＣＬＶ１）；可溶性表达；胞外结构域；共表达 　　中图分类号：Ｑ７８６文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）11－2259-04 　　 　　Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＲＲ－ＲＬＫ Ｆａｍｉｌｙ ??ｒｏｔｅｉｎ ＣＬＶ１ Ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ 　　 　　ＬＩ Ｆｅｎｇ，ＹＡＮ Ｘｉａｏ－ｊｉｎ，ＨＡＮ Ｃｕｉ－ｘｉａｏ，ＦＥＮG Ｄｕｏ，ＬＩ Ｑｉａｎ－ｑｉａｎ，ＧＡＯ Ｗｅｉ 　　（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｔｒｅｅ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ / Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３， Ｃｈｉｎａ） 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｓｏｌｕｂｌｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＬＲＲ－ＲＬＫ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＬＡＶＡＴＡ１ ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ （ＣＬＶ１－ＥＣＤ） ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｆｕｓｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ＮｕｓＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｅ． ｃｏｌｉ． Ｔｈｅ ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＬＶ１－ＥＣＤ ａｎｄ ｌｉｇａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＬＡＶＡＴＡ３（ＣＬＶ３） ｃｏｕｌｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＣＬＶ１－ＥＣＤ． Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｃｏｕｌｄ ａｖｏｉｄ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｙ′ｓ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ， ａｎｄ could ｏｂｔａｉｎ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｈｉｃｈ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ for ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ ＣＬＡＶＡＴＡ ｓｉｇｎａｌ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ（ＬＲＲ）； ＣＬＡＶＡＴＡ１（ＣＬＶ１）； ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎ； ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 　　 　　植物体茎端分生组织（Ｓｈｏｏｔ ａｐｉｃａｌ ｍｅｒｉｓｔｅｍ，ＳＡＭ）是植物体胚后发育所有地上部分（Ａｅｒｉａｌ ｐａｒｔｓ）器官发生的源泉，高等植物最终形态主要依赖于ＳＡＭ发育调控［１］。ＳＡＭ的干细胞分化与分裂之间的平衡由ＣＬＡＶＡＴＡ基因与ＷＵＳＣＨＥＬ（ＷＵＳ）组成的负反馈调节环控制［２］。ＣＬＡＶＡＴＡ基因（ＣＬＶ１，ＣＬＶ２，ＣＬＶ３）通过抑制转录因子ＷＵＳ的表达来限制干细胞的数目，促进干细胞的分化，而ＷＵＳ转录因子的表达可促进ＣＬＶ３基因的表达，从而维持干细胞特性［３－５］。 　　ＣＬＶ１基因编码一个由９８０个氨基酸组成的１０５ ｋｕ的膜蛋白，该蛋白具有３个结构域，即由２１个亮氨酸重复序列（Ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ，ＬＲＲ）组成的胞外结构域（Ectodomain，ECD）、单次跨膜区和一个胞内ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ激酶区组成，属于富亮氨酸重复的类受体蛋白激酶（ＬＲＲ－ＲＬＫ）家族。最近日本研究人员利用光亲和标记（Ｐｈｏｔｏ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｌａｂｅｌｉｎｇ）技术证明了多肽信号ＣＬＶ３是直接与ＣＬＶ１的胞外结构域（CLV1-ECD）结合的，而胞内激酶区对多肽信号的结合力没有影响［６］。CLV1-ECD共有６１５个氨基酸，由２１个ＬＲＲ基序组成，疏水氨基酸占到了４６．５％，其中有９３个亮氨酸和４５个异亮氨酸。Ｗｉｋｉｎｓｏｎ等［７］和Ｓｍｉａｌｏｗｓｋｉ等［８］的研究表明蛋白质异源表达的可溶性与氨基酸的组成有很大关系，而亮（异亮）氨酸含有较长的疏水性脂肪族侧链基团，在水中的溶解度极小。因此该类蛋白在原核表达过程中常常形成包涵体，不利于下一步结构与功能的研究。 　　本实验拟用载体质粒ｐＥＴ４４ａ携带的大肠杆菌ＮｕｓＡ蛋白与拟南芥ＣＬＶ１-ECD融合表达，实