肺癌干细胞的分离鉴定及线粒体能量代谢特性的分析-isolation and identification of lung cancer stem cells and analysis of mitochondrial energy metabolism characteristics.docx

肺癌干细胞的分离鉴定及线粒体能量代谢特性的研究摘要越来越多的证据表明，肿瘤干细胞(cancerstemcells，CSCs)是恶性肿瘤发生、进展和复发的“根源”。近年来，研究者对该亚群细胞的增殖与分化、治疗抵抗、侵袭转移能力、免疫逃逸、缺氧耐受以及诱导血管新生等重要生物学特性进行了深入、细致的观察，相关研究结果正深刻地改变着我们对恶性肿瘤发生、侵袭/转移、治疗耐受以及复发的认识。然而，目前对于CSCs线粒体及其相关的能量代谢特征，尚缺乏相关的研究。线粒体是维持真核细胞生存的重要细胞器之一，主要负责将营养物质转换成能量分子--三磷酸腺苷(ATP)，从而为细胞活动提供能量，在细胞增殖、凋亡、类固醇代谢、钙平衡的调节等生理活动中扮演着不可或缺的角色，其功能和结构异常与恶性肿瘤的发生和进展密切相关；而更为有趣的是，最近研究结果表明，线粒体的形态、分布、数量以及相关能量代谢参数，对调控正常干细胞的自我更新、多潜能性以及增殖/分化等具有重要的作用。因此，观察CSCs线粒体及相关能量代谢特征，有助于我们深入地认识CSCs的生物学特性，同时，鉴于CSCs在恶性肿瘤中的核心地位，这也将有助于我们更加全面的了解恶性肿瘤肿瘤的发生、发展和复发。本课题在从肺腺癌A549细胞系中分离和鉴定肺癌干细胞(lungcancerstemcells，LCSCs)的基础之上，观察LCSCs线粒体的数量/空间分布、线粒体DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)拷贝、线粒体膜电位(mitochondrialmembranepotential，?ψm)，葡萄糖消耗、氧耗量以及细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)和ATP浓度。并初步探讨了肺癌细胞群体?ψm异质性在分离和富集LCSCs中的作用。研究结果可为深入了解LCSCs的生物学特性提供新的实验依据。目的1.从肺腺癌A549细胞系中分离鉴定LCSCs。2.探讨LCSC细胞亚群线粒体能量代谢的生物学特性变化。3.探讨利用?ψm异质性进行分离和富集LCSCs的可行性。实验方法1.LCSCs的分离、培养及鉴定肺腺癌A549细胞低密度培养于含血清培养基，克隆形成后，挑选紧密性克隆细胞置于改良的无血清干细胞培养基中培养出肺癌干细胞球(sphere)；免疫荧光激光共聚焦显微镜检测其干细胞相关标志物的表达情况；Real-timePCR检测干细胞相关标志物mRNA的转录情况；将其置于含血清分化培养基中，免疫荧光激光共聚焦显微镜检测子代细胞中干细胞标志物和分化标志物表达改变的情况；皮下接种于裸鼠，观察成瘤能力；取移植瘤标本，行HE染色观察其病理学特征，并行免疫荧光激光共聚焦显微镜检测，观察相关标志物的表达情况。2.LCSCs线粒体及能量代谢特性的观察2.1以Mito-TrackerGreen(线粒体绿色荧光探针)标记细胞线粒体，细胞膜红色探针1，1-十八烷-3，3，3，3-四甲基印度羰花青高氯酸盐(1，1-dioctadecyl-3，3，3，3-tetramethylindocarbocyanineperchlorate，DiI)标记细胞膜，激光共聚焦观察A549细胞线粒体空间分布形态。2.2以Mito-TrackerGreen标记细胞线粒体，Hoechst33342标记细胞核，激光共聚焦观察A549细胞中侧群(sidepopulation，SP)细胞和非SP细胞线粒体空间分布和线粒体数量；并以Mito-TrackerGreen标记细胞线粒体后，流式细胞术比较LCSCs、无血清单层贴壁细胞(monolayer)、A549细胞系及LCSCs分化后各时间点细胞的线粒体数量。2.3以Real-timePCR方法检测LCSCs、无血清单层贴壁细胞、A549细胞系及LCSCs分化后各时间点细胞的线粒体DNA拷贝数。2.4以罗丹明123(Rh123，?ψm探针)标记细胞线粒体，流式细胞术检测LCSCs、无血清单层贴壁细胞、A549细胞系及LCSCs分化后各时间点细胞的?ψm。2.5以荧光素－荧光素酶方法，检测检测LCSCs、无血清单层贴壁细胞、A549细胞系及LCSCs分化后各时间点细胞的ATP浓度。2.6以荧光探针DCFH-DA标记ROS的方法，流式细胞术检测LCSCs、无血清单层贴壁细胞、A549细胞系及LCSCs分化后各时间点细胞的ROS浓度。2.7以葡萄糖氧化酶法，通过酶标仪检测LCSCs、无血清单层贴壁细胞在无血清培养下，和A549细胞系分别在10%胎牛血清的DMEM培养基及无血清培养下，各组细胞在24h和48h的的葡萄糖消耗量。2.8提取LCSCs、无血清单层贴壁细胞、A549细胞系及LCSCs分化后各时间点细胞的线粒体，采用Clark-type氧电极法测定线粒体呼吸控制率(respiratio