柑桔溃疡病菌的pcr快速检测技术分析-analysis of pcr rapid detection technology of citrus canker pathogen.docxVIP

缩略词bp BSA CTAB DMF DNA dNTP EB EDTA FITCgIPTG?KbMb OD260oligoPCRPfuRNARNasebase pairs碱基对bovine serum albumin牛血清白蛋白cetyltrimethylamìnoni um bromide十六烧基三乙基漠化镀dimethyformamide二甲基甲酌胶 deoxyribonucleic acid脱氧核糖核酸 deoxynucleoside triphosphate脱氧核背三磷酸 ethidium bromide漠化乙绽 ethylenediaminetetraacetic acid乙二版四乙酸 fluoresceinisothiocyanate异硫氨酸荧光素 gravity重力isopropyl-l 拍ioφD-dalactosíde异丙基-?-D蛐硫代半乳糖毗喃糖背k?lobase pairs千碱基对million base pairs百万碱基对optic?l density at 260 nm260 nm 吸光度oligonucleotide寡核背酸polymerasechain reaction聚合酶链式反应Pyrococcusfuriosis激烈熟、球菌 ribonucleic acid核糖核酸 ribonuclease核糖核酸酶SDS TAEsodium dodecyl sulfate Tris/acetate/ (bu货运。十二姨基硫酸锅Tris/ 乙酸电泳缓冲液TaqThermus aquaticus栖热水生菌TETris?DTA (bu俗。 Tris?DTA( 缓冲液)Tmmelting (or midpoint) temperature ，thermal denaturation解链(热变性〉温度TrisTris (hydroxymethyl) aminomethane三(泾甲基)氨基甲 4烧Uunit，uracì1 or uridine单位?尿咯、咬、尿营gal5也romo-4-cl巾ro小indolylφD-galactoside子澳-4-氯瞩3-P51呆φ0-半乳糖音IV西南农业大学 2004 届硕士学位论文摘要摘要柑桔溃殇病 (Citrus Bacterial Canker Disease，CBCD)是由地毯草黄单胞杆菌柑桔致病变 种 (Xanthomonas axonopodis pv. ci以Xac) 引起的一种影响全球柑桔产业发展的国内外重大检 疫性病害。其主要通过显症或带菌种苗、接穗、果实等柑桔材料的调运进行远距离传播，田 间病害主要靠病菌随风夹雨扩散，病菌在自然状态下的存活期较长。对于该病的检疫检验， 除传统的方法外，近年米国外己发展了 PCR 检验技术，但现有技术在特异性和稳定性等方面 还存在着一些问题，制样技术亦繁杂费时，并且国内外均无适合实际应用的检测试剂盒研制 的报道。我国加入 WTO 以后，柑桔溃殇病检疫的新形势迫切要求建立一种快速、灵敏、准确 的分子诊断和检验技术体系，而国内尚无这方面的研究报道.研究目的:本研究通过检测稳定性好、灵敏度高的特异性引物的设计与筛选，无害化参 照体系的构建，简便快速的浸泡制样技术研究和常温贮藏检测试剂盒的研制，旨在建立起快 速准确而又稳定安全的柑桔渎殇病菌 PCR 检测技术体系，实现大量柑桔样品的快速检验，为 柑桔非疫生产区建设和病害预警监测提供一种分子检测技术和实用工具。研究方法 t 利用引物和探针设计软件 Primer Premier 5.0 进行引物的设计:通过扩增靶片 段序列在核背酸序列数据库中进行相似性比对的方法和近缘细菌进行 PCR 扩增的方法验证了 检测的特异性:通过对不同浓度的柑桔溃殇病菌 DNA 和菌液的 PCR 扩增测定了检测的灵敏 度:通过在不同 DNA 扩增仪和温度控制方式下的扩增程序调试以及在不同实验室的验证测试.保证了检测的稳定性。将靶片段与克隆载体连接后，用CaCh 法转化大肠杆菌 (JMI09) ，然 后通过测序来验证 PCR 扩增的正确性:以重组质粒和转化的大肠杆菌构建了无害化参照体系。 利用浸泡浓缩法优化了制样技术:采用预混 PCR 反应液中加入生物活性分子稳定剂并冷冻干 燥困相化包被处理的方法研制出能常温贮存的方便有效的检测试剂盒.利用优化的分子检测 体系对四川、广西、湖南和重庆等地采集的柑桔样品进行了PCR 实际检测，并且部分样品进 行了分离培养和致病性测定验证。研究结果 z1) 基于柑桔溃荡病菌 A 菌系染色体中的独杳保守蛋白基因设计筛选的寻|物 JYF5/JYR5 ， 用于柑桔溃殇病菌的 PCR 检测具有很高的特异性、灵敏度和稳定性。扩增的靶片段序列在核 背酸序列数据库中相似性比对结果显示 2