seldi-tof-ms技术对肝癌裸鼠移植瘤模型体内微量蛋白谱分析-sel di - tof - ms technique for analysis of trace protein spectra in nude mice model of hepatocellular carcinoma transplanted tumor.docxVIP

前言原发性肝癌是临床常见恶性肿瘤之一，发病率在全世界排名第五、我国排名第三，且近几年发病趋势逐年走高[1]。原发性肝癌的病因与诱因多种多样，且与家族遗传史高度相关，其它与原发性肝癌发病相关的主要因素包括居住环境、饮食和水源、吸烟饮酒等生活习惯，细菌、病毒和寄生虫感染亦是诱发肝癌的可能因素[2]。目前，原发性肝癌的临床诊断方法主要包括各种实验室检查、肝脏超声检查、CT、磁共振、正电子发射计算机断层扫描、选择性肝动脉造影等，但是这些方法都很难达到理想的效果，在早期诊断中均有较高的误诊和漏诊率，一些侵入性的检查对患者身体损害较大，具有严格的应用指标[3]。近年来，蛋白质组学被广泛应用于医学的各个领域，其含义由两部分构成，即蛋白质（protein）与基因组学（genomics），蛋白质组（proteome）的具体含义为“一个基因所表达的全部蛋白质”。蛋白质组学是从蛋白质水平上对基因表达所进行的定量检测，从而对生物学行为和基因表达调控的机制起到一定的揭示作用，其是一门新兴的学科[4]。蛋白质组学的研究内容很广泛，主要包括利用蛋白芯片和免疫共沉淀等技术鉴定蛋白质的种类；研究各种蛋白质的翻译后修饰，以期阐明其具体的生物学功能；对蛋白质的各项职能信息进行研究，探索其与某些疾病是否具有内在相关性；研究多种蛋白质彼此的作用机制等。蛋白质组学常用到的研究方法和技术包括：（1）双向凝胶电泳技术，其是目前是蛋白质组研究首选的分离技术，而基于双向凝胶电泳技术衍生出的蛋白质分离技术也在研究和实践中越来越多；（2）生物质谱技术，其在目前蛋白质组学研究技术中发展十分迅猛，也被广大专家和学者们公认为是最具生命活力的技术；（3）生物信息学数据库，生物信息学技术是蛋白质组学后期研究的有效工具和有力保障；（4）蛋白印记技术等。然而，上述各种方法技术普遍都存在着实验步骤繁琐、灵敏度低、特异性差等不同的缺点，所以我们需要探索一种新的技术路线来解决以上的问题[5-7]。虽然，近年来，原发性肝癌的实验室诊断，尤其是早期诊断的研究在各国专家和学者们的不断探索下已经取得了较大的进展，但是在所用的各个指标和实验学方法等方面都还存在着一定的问题。例如，目前肝癌的实验室诊断仍然停留在甲胎蛋白（AFP）极其异质体、特异性的血清酶、铁蛋白和肝细胞生长因子等少数生物活性因子的检测上面，其灵敏度、特异性等均不能满足临床的诊疗需求；另外，由于研究中标本选取的一致性难以控制，再加上各种人为因素干预造成的误差，使得研究的结果不甚理想。为了更好的进行课题研究，有效的减少上述种种误差，我们可以选择利用实验动物建立标准化的肿瘤疾病模型，这样就可以很大程度上避免实验过程中的各种不足。用于构建标准化肿瘤疾病模型的实验动物中，目前裸鼠的应用是比较广泛的，因其具有许多特有的生物和生理学特点，在肿瘤学、毒理学、免疫学等多方面应用效果均很好[8]。肝癌裸鼠移植瘤模型构建的常用方法包括：（1）肝癌原位接种动物模型；（2）肝癌腹膜下接种动物模型；（3）肝癌皮下接种动物模型；在本课题中，我们选取的是肝癌细胞皮下接种构建移植瘤模型。表面增强激光解吸电离蛋白质芯片(surface-enhancedlaserdesorption／ionization，SELDI)技术近几年来发展日新月异，为我们对蛋白组学技术进行研究提供了更好的技术支持，其在研究技术和方法学方面的优势均十分明显。本课题采用表面增强激光解析电离飞行时间质谱(surfaceenhancedlaserdesorption／inionation，SELDI-TOF-MS)技术分别对裸鼠肝癌移植瘤模型实验组和对照组血清微量蛋白谱进行检测，通过对比筛选出有意义的差异表达蛋白，为我们继续研究肝癌的诊断和早期诊断开辟了一道新的曙光。SELDI-TOF-MS技术十分适合于对差异蛋白质组学进行研究，在现有的方法学技术中具有相当的潜力和活力[9-10]。SELDI-TOF-MS技术是基于以下的原理：SELDI-TOF-MS系统包括蛋白质芯片阵列和质谱仪，前者主要由蛋白芯片、芯片阅读器和分析软件三部分组成。将经过预处理的需检标本加样在已成功活化的芯片上，通过激光作用，结合于芯片的蛋白质发生电离、解吸附形成带电粒子，质荷比不相同的带电离子在通过电场时被加速的飞行时间也不一样，记录其飞行时间，经过计算机软件处理后绘制成图，即可直观显示样品中所含蛋白质的量和相对分子质量等各项基本信息。通过对已知的质谱图和数据进行差异性的分析，寻找其中对研究有统计学上鉴别意义的质谱图[11]。SELDI-TOF-MS技术在各个方面的优势都较明显：（1）样本无需纯化，可直接检测粗提取样品，如血液、尿液、细胞液等；（2）检测耗时短，标本需求微量，一般在几分钟内即可完成检测，速度快；（3）大规模、高通量、可定量、重