第四章高效液相色谱分析 PPT课件.ppt

光电二极管阵列检测器 第五节 高效毛细管电泳简介 2、电泳现象与电渗流现象 3、分离过程： 4、分离类型 二、仪器装置 三、主要特点和应用 第六节 纸层析和薄层层析法 三、特点及应用 2. 固定相 3. 流动相的要求：能溶解样品且与凝胶相似（润湿凝胶）、粘度小（增加扩散速度）。 六、离子对色谱法（IPC） 主要用来分离强极性有机酸和有机碱。 原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子与对离子形成离子对AB，该AB离子对的性质与A离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子的保留特性。 七、亲合色谱 主要用于生物大分子与固定相之间的特异亲合力进行选择性分离及纯化的方法。 特点：选择性过滤、纯化效果好。 第四节 色谱分离方法的选择 一般可根据试样相对分子质量范围、溶解度及分子结构等进行分离方法的初步选择。 一、根据相对分子质量选择 二、根据溶解性选择 三、根据分子结构选择 一、基本原理 1、概述 在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同可实现分离。 毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据试样中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离、分析物质的一类液相技术，是经典电泳和现代微柱分离的结合。 电泳现象：带电离子在电场作用下的迁移（定向移动），速度ν电泳 电渗流现象：石英玻璃表面存在硅羟基，pH3时, 形成双电层，在高电场的作用下，双电层中的水合阳离子引起毛细管中的溶液整体向负极移动，速度ν电渗流 毛细管区带电泳（CZE）：最普遍、最基本的一种分离模式。 毛细管凝胶电泳（CGE）：将聚丙烯酰胺在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、DNA等。 毛细管胶束电动力学色谱（MECC）： 用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。 电压：0～30KV。 分离柱不涂敷任何固定液； 紫外或激光诱导荧光检测器（10-19～10-21 mol/L） 高分辨率：理论n高达数百万块，甚至数千万块； 高灵敏度：可检测出低至10-21 mol/L浓度的物质； 高分析速度：可在3分钟内分离30种阴离子；1.7分钟分离19种阳离子；4分钟可分离10种蛋白质； 试样用量少：仅需几nL（10-9 L）的试样； 仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升流动液。 * 第四章 高效液相色谱分析 1、 概述 2、 HPLC仪器 3、高效液相色谱法的类型及分离原理 4、色谱分离方法的选择 5、高效毛细管电泳简介 6、纸层析和薄层层析 教学目标及要求 1、掌握高效液相色谱法的特点及适用范围，与GC及经典LC的异同。 2、掌握高效液相色谱仪的主要部件及基本流程。 3、理解常用检测器的原理、适用的分析对象及适用范围。 4、理解各种分离方式的原理及选择原则。 5、了解高效毛细管电泳基本原理、仪器及特点。 6、了解纸层析和薄层层析分离过程、操作技术及特点。 第一节 概述 高效液相色谱（HPLC）是一种以液体为流动相的快速分离分析色谱技术，采用细微粒固定相、高压输液泵和高灵敏度检测器，具有高压、高速、高效、高灵敏度的特点，对于那些沸点高，热稳定性差，相对分子质量大的有机化合物如烷烃、烯烃、芳烃、染料、甾族化合物、蛋白质、氨基酸、核酸等均可进行分离分析。 按照固定相不同分为：液液分配色谱；吸附色谱（液固色谱）；离子交换色谱；尺寸排阻色谱（凝胶渗透色谱）；离子色谱、平板色谱（薄层色谱）等。 1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较 高压： HPlC供液压力和进样压力都很高（150～350X105Pa）。高压是的一个突出特点。 高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加，分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重力加料，完成一次分析需时数小时。 高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分钟内完成数百种物质的分离。 高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g, 荧光检测器——10-11g。 2. HPLC与GC的比较 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定有机化合物（占总数的20%）；HPLC可分析高沸点、高分子量的稳定或不稳定有机化合物（占80%）。 流动相的选择：GC采用的流动相为几种“惰性”气体，只起运