GST融合蛋白亲和色谱法剖析转录因子AP-2α与TES蛋白的相互作用.pdfVIP

GST融合蛋白亲和色谱法分析转录因子AP-2 α与TES蛋白的相互作用 摘 要 亲和色谱又称为亲和层析,是一种利用与固定相高度特异结合（如抗原与抗体、 酶与底物、受体与配基的结合等）的特性将特定组分从混合物中分离出来的色谱方 法，常用于生化大分子的分离与纯化。亲和色谱法的出现大幅提高了蛋白质纯化的 速度与效率，同时也为蛋白质潜在相互作用伙伴研究（如pull-down、共纯化）提供 了技术平台。Pull-down技术的基本原理是用固相化的亲和配基捕获细胞裂解液中的 带有纯化标签（该标签能与固相化配基特异结合）的融合蛋白，再以此为“诱饵”， 钓取与之相互作用的蛋白。固相化的“诱饵”蛋白可以用来试探与多种来源的（可 疑的或完全未知的）“猎物”蛋白的相互作用关系，从而判定“诱饵”和“猎物” 两个蛋白质之间是否存在相互作用。 本研究采用改良的亲和色谱法成功分离纯化了AP-2α和TES这两类目的蛋白， 并且利用GST融合蛋白亲和色谱技术(pull-down)分析了这两类蛋白之间的相互作用 关系。 转录因子通过对细胞内外刺激作出反应来调节基因的表达，它们常常通过控制 基因转录的基本机制在决定细胞的命运中起主要作用。AP-2α 作为一类重要的转录 因子AP-2家族的成员，具有组织表达特异性和DNA结合特异性。最近很多研究表明， AP-2α 通过与其它蛋白的相互作用在胚胎发育，细胞分化，肿瘤发生等方面发挥重 要作用，转录调控多个下游靶基因。在本室先前的实验中，以AP-2α为饵蛋白，用 酵母双杂交系统筛选HeLa细胞cDNA文库得到的阳性克隆中发现了TES。人类TES基 因在基因组中位于 7q31.2,近来很多报道表明该基因可能是一个潜在的肿瘤抑制基 因。TES 基因编码一个含有421个氨基酸残基的蛋白质序列，其蛋白N端是一个PET domain，C端则是三个紧邻的LIM domain。为了研究TES C端各LIM domain的功能， 确定 AP-2α 与之相互作用的具体位点，本文在含有 TES 基因全长编码序列的载体 pCMV-HA-TES 的基础上，用 PCR 扩增并克隆了 TES C 端含有的三个 LIM domain 编码 序列。将得到的片段亚克隆入原核表达载体pQE-N1，构建了表达质粒pQE-N1-LIM 1、 pQE-N1-LIM 2和pQE-N1-LIM 3。在大肠杆菌E.coli BL21中表达His融合蛋白并用 2+ 基于Ni 的固定金属离子亲和色谱对表达产物进行了纯化。 I GST融合蛋白亲和色谱法分析转录因子AP-2 α与TES蛋白的相互作用 用同样的方法构建编码 AP-2α 各蛋白片段的表达质粒并转入大肠杆菌 E.coli BL21，表达产物为与谷胱甘肽-S-转移酶融合的融合蛋白。菌体经超声破碎后,上清 液用谷胱苷肽琼脂糖4B凝胶珠亲和色谱法纯化，产物纯度在90%以上。 然后用自制的抗-His-TES抗体，通过 GST Pull-down技术分析了TES C端的三 个LIM domain与AP-2α各片段之间的相互作用。实验结果表明，AP-2α蛋白与TES 蛋白之间存在相互作用，是由于 AP-2α C 端能与 TES C 端的第一个 LIM domain 结 合；同时根据AP-2α蛋白只能与TES C端而不能与TES全长蛋白结合的实验事实提 出了 TES 蛋白存在自身相互作用的可能，导致 TES 蛋白至少存在开放（open）和封 闭（close）两种折叠构像。即位于TES蛋白C端的LIM domain可与TES蛋白自身N 端的PET domain发生直接相互作用，封闭了位于TES LIM domain 1上的AP-2α结 合位点，使TES蛋白处于封闭的构像，而不能与AP-2α发生相互作用。 关键词：AP-2α；TES基因；LIM 结构域；亲和色谱；相互作用 II GST融合蛋白亲和色谱法分析转录因子AP-2 α与TES蛋白的相互作用 ABSTRACT Affinity chromatography (i.e., affi