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P53基因状态与应用今又生疗效研究 　　【摘要】目的:p53是迄今临床发现与肿瘤发病相关性最高的肿瘤抑制基因(TSG),是肺癌中发生频率最高的遗传改变。本研究的目的观察肺腺癌细胞中p53基因突变对状态对重组人p53腺病毒注射液治疗疗效的影响。方法:将重组腺病毒载体所携带的野生型p53 基因导入人肺腺癌耐药细胞株GLC-82及A549,通过Western blot 法分析外源野生型p53 基因在细胞内的表达, MTT 法和流式细胞术观察对细胞生长抑制及细胞周期、凋亡的影响。结果:通过Western blot 证实了外源p53 基因能在GLC-82 及A549 细胞中高效表达。MTT 法观察到Ad-p53 对肺癌细胞的抑制作用呈时间依赖性、剂量依赖性效应,流式细胞术检测结果显示, Ad-p53与能使细胞阻滞于G0～G1 期, S 期细胞比例明显减少,引起的A549 细胞凋亡率为(15.35±1.31) %, GLC-82 细胞凋亡率为(20.88±0.71) %。结论:Ad-p53能可以抑制含突变型p53 基因及含野生型p53 基因的人肺腺癌细胞株的生长,???进其凋亡,作用效应不受内源性p53 状况的影响。 　　【关键词】重组人p53腺病毒;肺癌;p53基因 　　【中图分类号】R743.2 【文献标识码】A 【文章编号】1006-1959(2009)09-0002-02 　　 　　p53基因是重要的肿瘤抑制基因,同时肺癌中p53基因突变率较高,所以rAd-p53基因治疗肺癌的研究受到广泛的重视。但有些肺癌患者p53基因并没有发生突变,因此,我们研究应用Ad2-p53 制剂将重组腺病毒载体所携带的野生型p53 基因导入人肺腺癌细胞株GLC-82 (含突变型p53 基因) 及A549(含野生型p53 基因) 中,观察肺腺癌细胞中p53基因突变对状态对重组人p53腺病毒注射液治疗疗效的影响。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 材料与试剂、仪器:人肺腺癌细胞株GLC-82 购自中科院肿瘤所分子肿瘤学国家重点实验室,A549购自上海细胞所。试剂:Ad-p53 注射液(今又生) 由深圳市赛百诺基因技术公司提供,DDP 购自山东齐鲁制药厂,一抗兔抗人p53 多克隆抗体(FL-393:sc-6243) 及羊抗兔二抗购自Santa Cruz 公司,一抗羊抗人β-actin单克隆抗体及兔抗羊二抗购自Sigma 公司, RPMI1640 购自GIBCO 公司,新生牛血清购自中美合资兰州民海生物工程有限公司,噻唑蓝(MTT) 、DMSO 购自Sigma 公司。 　　主要仪器: ELX800 酶标仪(美国BIO-TEK INSTRUMEN TS) 、流式细胞仪(美国BD-FACS Vantage SE) 和半干电子转膜仪(瑞典LKB)。 　　1.2 腺病毒滴度测定:Ad-p53 剂量为1 ×1012 VP/(mL#8226;支) (VP :病毒颗粒,virus particle),空斑实验确定其滴度为1 ×1010 PFU/(mL#8226;支) (PFU :空斑形成单位, plaque-forming unit),分装后-20℃保存。 　　1.3 细胞培养:将GLC-82及A549 细胞均接种于含10%新生牛血清的RPMI 1640 培养基中,置5% CO2 、饱和湿度、37℃培养箱中培养。细胞为贴壁生长,0.125%的胰蛋白酶消化传代,1～2d换液一次。 　　1.4 实验分组:取对数生长期细胞,接种20×104个细胞于25ml的培养瓶中,培养24h 细胞贴壁后,再分成3组。对照组(A组):未经Ad-p53处理的RPMI 1640 完全培养基;实验组(B组)100MOIAd-P53感染细胞的RPMI1640 完全培养基; 72h后提取细胞总蛋白质。 　　1.5 Western blot 检测:用Bradford 法测定蛋白质浓度。分别取30μg 蛋白质在10%聚丙烯酰胺凝胶15mA 电泳3h,30mA 半干转膜2h,5%脱脂牛奶室温封闭1h,接着分别与兔抗人p53 多克隆抗体(1∶500) 和羊抗人β2actin 单克隆抗体(1∶2000) 室温温育2h,然后分别与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 抗体(1∶1000) 和兔抗羊IgG抗体(1∶5000) 室温温育1h,应用发光试剂盒显示蛋白质条带。 　　1.6 MTT比色法:取对数生长期的A549/DDP 细胞按1×104/孔接种于96孔培养板,每孔加液量200μL。24h 后换液,设空白调零组(不接种细胞)及实验组。每组设3个复孔。分别继续培养24、48、72h 后小心吸出培养液,加入MTT 试剂(5g/L)20μL, 空白调零组加入20μL PBS,继续培