新辅助动脉化疗对宫颈癌细胞凋亡及Bcl-2Bax影响.docVIP

新辅助动脉化疗对宫颈癌细胞凋亡及Bcl-2Bax影响 　　作者单位：510180 广州市第一人民医院 　　通讯作者：陈佩锋 　　【摘要】 目的 检测宫颈癌行新辅助动脉化疗后细胞凋亡及Bcl-2、Bax的变化，探讨其意义。方法 选取宫颈癌Ⅰb2～Ⅱb期患者46例，动脉化疗前后宫颈活检，采用DNA片段末端标记法检测凋亡细胞，免疫组化法检测Bcl-2及Bax蛋白。结果 动脉化疗后，细胞凋亡指数（%）由0.67±0.21升高至3.57±1.29，P2期9例，Ⅱa期15例，Ⅱb期22例。先行动脉灌注栓塞化疗，根据化疗效果决定下一步行放疗或手术治疗，化疗前取活检，化疗后2周进一步治疗前再次活检。标本以10%甲醛固定后，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片制成玻片。 　　1.2 方法 　　1.2.1 动脉化疗 常规右侧股动脉穿刺插管后，在DSA显影下以Seldingers技术将导管置入双侧骼内动脉，造影后超选择插管进入子宫动脉，缓慢推注卡铂2/3量，持续20 min，后以新鲜明胶海绵颗粒混合1/3量的卡铂栓塞子宫动脉，造影证实栓塞完全后，退导管至髂内动脉前干，灌注博莱霉素30 mg（双侧）。化疗方案为卡铂［按肌酐清除率×5 mg/（ml?min）计算］＋博莱霉素30 mg（总量）。 　　1.2.2 凋亡检测 通过DNA片段末端标记（Fragment End Labeling，FragELTM）检测凋亡细胞。试剂盒购于德国Calbiochem公司，具体步骤参照试剂盒说明进行。阳性对照为经蛋白酶K及Dnase I处理后的标本，阴性对照以dH2O代替TdT制成。 　　1.2.3 Bcl-2、Bax的检测 采用相应单克隆抗体以免疫组化S-P法检测，试剂盒购于福州迈新生物技术有限公司，具体步骤参照试剂盒说明进行。以已知阳性切片为阳性对照，以PBS代替一抗为阴性对照。 　　1.2.4 结果判定 凋亡细胞以细胞核出现棕黄色颗粒，同时伴有细胞体积缩小、核固缩或呈碎裂状为阳性，Bcl-2以细胞膜及细胞浆显示棕黄色颗粒为阳性，Bax以细胞浆中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性。随机观察5个高倍视野，计算每一病例阳性细胞的比例，以百分率表示，称为标记指数，凋亡指数为AI。Bcl-2和Bax阳性率10%定义为阳性，4 cm及宫旁有浸润，直接手术具有较大难度或不能彻底切除病灶的患者在手术、放疗前进行1～2个疗程的化疗，再施行根治性手术或根治性放疗。笔??所在医院对局部晚期宫颈癌采用介入方法先行动脉灌注栓塞化疗1个疗程，后根据化疗效果决定下一步手术治疗或放疗，临床疗效明显。本研究针对肿瘤细胞凋亡及其相关凋亡因子Bcl-2、Bax进行检测，以证明动脉化疗具有促癌细胞凋亡的作用及探讨其机制。 　　肿瘤的发生发展，不仅与细胞的增殖、分化异常有关，也与细胞凋亡的调节紊乱有关。细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是一种主动的、由基因调控、不同于坏死的细胞死亡形式，是生物体维持细胞数量相对稳定的重要环节［1］。在细胞凋亡过程中有多种癌基因和细胞内信使参与调节，其中Bcl-2家族的表达和调控在细胞凋亡信号转导途径中发挥着重要作用。根据在细胞凋亡调控中的不同作用，Bcl-2家族分为促进凋亡基因和抑制凋亡基因，最有代表性的分别是Bax和Bcl-2。Bcl-2基因位于染色体18q21，其表达产物Bcl-2蛋白主要位于线粒体外膜，具有拮抗促凋亡蛋白的作用。Bax基因位于染色体19q13，其蛋白主要位于细胞浆中，当凋亡发生时它从细胞浆转移到线粒体与线粒体膜结合，再与位于线粒体的Bcl-2相互作用而发挥诱导凋亡作用［2,3］。Bcl-2与Bax形成异源二聚体，维持促凋亡蛋白在细胞内的定位。当Bcl-2基因表达增多时，Bcl-2与Bax形成异源二聚体增多，凋亡受抑制；当Bax过量表达时，自身形成同源二聚体，促进凋亡发生［4］，因此Bcl-2/Bax的比值决定细胞对凋亡刺激的反应。 　　研究发现，多种恶性肿瘤细胞内Bcl-2表达水平显著升高。王晓琴等［5］检测了宫颈上皮内瘤变及浸润癌组织中Bcl-2、Bax的表达，发现Bcl-2的表达随病变的进展阳性率增加，而Bax的表达则随病变进展而下降。郑秀惠等［6］研究锎中子放疗对宫颈癌细胞凋亡及Bcl-2、Bax的影响，发现放疗后肿瘤细胞凋亡阳性率明显升高，Bcl-2的表达无明显变化，Bax的表达阳性率明显升高，认为Bax表达增加是放疗诱导肿瘤细胞凋亡的途径之一。本研究结果显示，动脉化疗后宫颈癌组织中细胞凋亡明显增加，Bax表达明显升高而Bcl-2表达降低，Bcl-2/Bax的比值呈下降趋势，且与细胞凋亡率相关。提示动脉化疗治疗宫颈癌是通过加强Bax基因的表达，抑制Bcl-2的表达，降低Bcl-2/Bax的比值，从而诱导肿瘤细胞凋亡达到治疗目的，这与放