反义硫代寡核苷酸增强细胞毒药物抗乳腺癌活性的体外研究_论文.docxVIP

反义硫代寡核苷酸增强细胞毒药物抗乳腺癌活性的体外研究 【摘要】 目的 研究以HER2 mRNA为靶点的反义硫代脱氧寡核苷酸（SODNs）HA6722单用及与紫杉醇合用时对HER2过表达乳腺癌细胞株MDAMB453体外增殖的抑制作用。方法 选择HER2过表达的MDAMB453细胞与HER2低表达的MDAMB231细胞，MTT法观察HA6722单用及与紫杉醇合用时对两种肿瘤细胞增殖的影响；以末端转移酶介导的dUTP切口末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡。结果 HA6722及紫杉醇单用均可以剂量依赖方式抑制MDAMB453细胞的体外增殖， IC50值分别为±·L1(n=3, mean±s)和±·L-1（n=3, mean±s）。加用低剂量的HA6722可增强紫杉醇对MDAMB453细胞的抑制作用，IC50值由合用前的±·L-1降至±·L-1（n=3，P＜）。联合应用时，在IC50浓度下二者之间的联合指数（CI）为±(n=3)，其对MDAMB453细胞的相互作用表现为正性协同作用。结论 反义寡核苷酸HA6722与细胞毒药物紫杉醇合用对HER2过表达乳腺癌细胞的体外增殖抑制具有协同作用。 【关键词】 反义 寡核苷酸 乳腺癌 HER2 mRNA 紫杉醇 　0 引言 乳腺癌的化学治疗近年来有了长足的进展，然而，经多线治疗仍复发转移的晚期患者的治疗，仍然十分棘手。探索包括生物靶向治疗在内的新疗法已成为近年研究的热点之一。 本研究室的前期研究表明，以HER2 mRNA为靶点的特异性硫代反义寡核苷酸，可以抑制HER2过表达乳腺癌细胞株增殖活性[1]。本研究拟对既往合成的反义寡核苷酸HA6722 单用或与紫杉醇联用时的抗乳腺癌活性进行研究，试图探索乳腺癌治疗新方法。 　1 材料与方法 细胞系及培养 本研究采用的细胞株有：MDAMB453（HER2过表达），细胞培养所需的培养基为L15（Gibco, BRL），内含10%的胎牛血清（FCS，Hyclone），置37℃、不含CO2的培养箱中培养；MDAMB231（HER2低表达）的体外培养采用RPMI1640（Gibco, BRL）培养基，内含10%的胎牛血清（FCS，Hyclone），置37℃、含体积分数为5%的CO2培养箱中培养传代。当细胞生长至80%～85%融合时用%胰蛋白酶消化，传代和收集细胞。 硫代反义寡核苷酸的合成及体外脂质体转染 反义寡核苷酸的靶向HER2 mRNA反义寡核苷酸HA6722序列为含20个核苷酸的寡聚核苷酸，其命名原则及合成见文献报道[2]。全程硫代修饰，由北京赛百盛基因技术有限公司合成。序列如下：HA6722：5′CAG CAG CCG AGC CAG CCC GA3′ 琼脂糖凝胶电泳结果表明反义寡核苷酸纯度符合要求。反义寡核苷酸以无血清无抗生素的L15或RPMI1640培养基溶解浓度为50μmol·L-1的溶液，过滤除菌，-20℃储存，临用时稀释至所需浓度。 反义寡核苷酸体外脂质体转染按Invitrogen, Gibco BRL公司脂质体转染说明书所述方法进行。当培养细胞达到65%～70%融合时，进行转染，具体方法见文献[3]。 紫杉醇 由海南海药公司提供，30mg/支，临用时以无菌生理盐水稀释成所需浓度。 噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）法检测细胞活度 取对数生长期的上述细胞，以不同数量接种96孔培养板（Costar，USA），接种数量分别为：MDAMB453 5×104/孔、 MDAMB231 2×104孔。实验组及对照组细胞培养均设三个平行孔。待细胞生长至65%～70%融合时，用脂质体2 000将不同浓度的HA6722转染细胞4～6h，再加入同摩尔浓度的紫杉醇，随后继续培养24～72h，倾去培养液，加新鲜配置的MTT溶液（/ml）200μl，继续孵育4h，吸去MTT溶液，每孔加200μl DMSO, 轻轻震荡20～30min，酶联仪测定光吸收值（OD值）。 细胞凋亡（apoptosis）检测 凋亡试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。以100nmol·L-1的HA6722及紫杉醇分别单独处理MDAMB453细胞12h，以及用50nmol·L-1的HA6722和相同浓度的紫杉醇先后作用MDAMB453乳腺癌细胞6h，收集经紫杉醇及HA6722单药或联合作用后的MDAMB453乳腺癌细胞，离心涂片，按操作说明检测细胞凋亡。细胞核内出现棕褐色沉淀为阳性，反之为阴性。凋亡指数（AI）=（凋亡细胞数/计数总细胞数）×100%。 反义药物及紫杉醇的疗效评价 对数生长期的MDAMB453细胞及MDAMB231细胞经系列浓度的HA6