家蝇rabll基因鉴定及与免疫功能相关性的分析-identification of rab ll gene in musca domestica and analysis of its correlation with immune function.docxVIP

摘 要 摘要Rabll 蛋白是一种小 GTP 酶，定位高尔基体反面网状结构、胞质中的囊泡以及感杆 基底等膜系统中，与 GTP 的结合和水解过程相偶联，在囊泡的出芽、转运、粘附、锚 定和融合几个阶段起着重要的作用。作为能够传播多种疾病的病媒昆虫，家蝇 Musca domestica 常常生活在病原菌滋生的恶劣环境中，具有很强的适应能力。研究家蝇独特 的免疫调控机制，将为了解昆虫生理、免疫以及杀虫等方面提供新的思路。本论文以家蝇为研究对象，研究内容主要分为 6 个部分。1. 通过转录组数据分析、RT-PCR 及 RACE 技术从家蝇幼虫体内克隆获得类似 Rabll 基因的 cDNA 序列，经过同源分析，将其命名为 MdRabll，并对其氨基酸序列进 行了分析。Rabll 基因 cDNA 全长 1220 bp，包含一个 645 bp 的完整开放阅读框（ORF）， 根据 ORF 推导的 Rabll 肽由 214 个氨基酸残基组成，经 SignalP 程序预测此多肽不含有 信号肽，理论分于质量为 24.29 kD，等电点为 5.52。同源性分析表明，与黑腹果蝇 Drosophila melanogaster 的 Rabll 相似性最高（identity＝97％）2. 通过同源克隆得到家蝇 -actin 基因，检测了 -actin 基因作为分于内标的可靠性。 家蝇 -actin 基因 cDNA 序列全长 1380 bp，包含一个长度为 1056 bp 的开放阅读框，编 码 352 个氨基酸，经 SignalP 程序预测此多肽不含有信号肽，理论分于质量为 39.53 kD， 等电点为 5.47。该序列与许多物种的序列一致性均高于 94％。 -actin 表达量检测结果显 示热激后不同恢复时间其表达量无明显变化，且与未经热激处理的对照相比无显著差 异，可以作为研究受外界环境胁迫作用下昆虫体内不同基因表达水平高低的可靠内部参 照标准。3. 以家蝇管家基因 -actin 及 GAPDH 作为内参分于，利用实时定量 RT-qPCR 对经 大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）刺激，不同组 织，家蝇 Rabll 基因的 mRNA 表达水平进行定量分析。以基因定量结果显示，菌协迫 后家蝇体内 Rabll 的表达水平发生了显著变化，而且大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别刺 激后，Rabll 基因的表达变化模式非常相似，都在刺激 48 h 的时候达到高蜂。在家蝇不 同组织中，Rabll 表达量在肠和血淋巴中较高，其中在血淋巴中的表达量最高；而在表I 摘 要 皮中的表达量较低。4. 构建了家蝇 Rabll 基因的原核表达载体，并在大肠杆菌 DE3 体内进行诱导表达， 并用 Rabll 蛋白免疫新西兰大白兔制备了抗血清。5. 应用 RNA 干扰技术，饲喂能够有效抑制虫体中 Rabll 基因表达的干扰菌，并用 针刺法对幼虫进行大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 刺激。在刺激后，与未经 Rabll 菌体饲喂的家蝇幼虫相比，饲喂组存活率明显降低。6. 构建 EGFP-Rabll 荧光载体，利用细胞转染方法研究其在草地夜蛾细胞中的定位 情况。定位结果表明，Rabll 基因普遍定位于细胞的膜结构中，这与相关文献报道的 Rabll 在细胞中的分布相一致。关键词家蝇Rabll先天免疫IIAbstractAbstractRabll is a small GTPase implicated in membrane traffic, immunolocalizes to the trans-Golgi network, cytoplasmic vesicles, and the base of rhabdomeres and plays an important rool in the budding, trasport, tethering, docking and fusion of the vesicles. Being a pest that carrys many pathogenic organisms, Musca domestica L. （Diptera： Muscidae） lives in and has adapts well to the conditions that full of pathogenic microorganisms. As the house?ies are ubiquitous and harmful to our health, research on th