生物化学 第14章 核酸物理化学性质.pptVIP

Chapter14 核酸的物理化学性质 与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有碱性基团（碱基），因而核酸也具有两性性质。 由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（碱基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5。 RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2′-OH通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。DNA没有这种作用。 理解一般物理性质 掌握两性性质 掌握紫外吸收 掌握变性与复性 了解核酸的酸解与碱解 * * * 核酸的水解 酸碱性质 紫外吸收 变性和复性 本章要点 一、核酸的水解 （一）酸水解或碱水解 核酸分子中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断。 DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。 DNA一般对碱稳定，RNA对碱不稳定。 （一）核酸的酸水解或碱水解 例如，在0.1 mol/L NaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解，生成2′或3′磷酸核苷；DNA在同样条件下则不受影响。 一、核酸的水解 在RNA水解时，2′-OH首先进攻磷酸基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用形成水解产物。 （二）酶水解 生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解多聚核苷酸链中的磷酸二酯键。 以DNA为底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA为底物的RNA水解酶（RNases）。 一、核酸的水解 （二）酶水解 根据作用方式可分作两类：核酸外切酶和核酸内切酶。 核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3′端或5′端）开始，逐个水解切除核苷酸； 核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。 在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。 一、核酸的水解 限制性核酸内切酶具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序、切点 二、核酸的酸碱性质 三、核酸的紫外吸收 在核酸分子中，由于嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系，因而具有独特的紫外线吸收光谱，最大吸收峰波长在260nm处，可以作为核酸及其组份定性和定量测定的依据。 三、核酸的紫外吸收 增色效应：核酸发生变性时，吸光度增加的现象。 减色效应：复性后，吸光度又降低的效应。 四、核酸的变性、复性及杂交 (一) 核酸的变性(denaturation) 1、核酸的变性:维系核酸三维结构的氢键如果受到某些理化因素的破坏，其三维结构就要改变，从而引起理化性质及生物学功能的改变，这种现象称为核酸的变性。 四、核酸的变性、复性及杂交 (一) 核酸的变性(denaturation) 2、特征：变性核酸将失去其部分或全部的生物活性。核酸的变性并不涉及磷酸二酯键的断裂，所以它的一级结构(碱基顺序)保持不变。 3、引起核酸变性的因素：温度升高、酸碱度改变、甲醛、尿素 变性与降解的区别：是否涉及共价键的断裂和分子量的改变 4、Tm值 定义：加热变性使DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的熔点或溶解温度，用Tm表示。 影响DNA Tm大小的因素：DNA的均一性；G-C含量；介质中的离子强度。 G和C的含量高，Tm值高。因而测定Tm值，可反映DNA分子中G-C含量，可通过经验公式计算： （G+C）%=(Tm-69.3)X2.44 当DNA的稀盐溶液加热到80-100℃时，双螺旋结构即发生解体，两条链彼此分开，形成无规线团。 DNA变性后，它的一系列性质也随之发生变化，如紫外吸收(260 nm)值升高, 粘度降低等。 （G+C）%=(Tm-69.3)X2.44 四、核酸的变性、复性及杂交 (二) 核酸的复性(renaturation) 核酸的复性:变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性。DNA复性后，一系列性质将得到恢复，但是生物活性一般只能得到部分的恢复。 四、核酸的变性、复性及杂交 (二) 核酸的复性(renaturation) DNA复性的程度、速率与复性过程的条件有关。 热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不可能复性。 变性的DNA缓慢冷却时，可以复性。 分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，DNA的复性也与它本身的组成和结构有关。 四、核酸的变性、复性及杂交 (二) 核酸的复性(renaturation) (三) 核酸的杂交(hybridization) 热变性的DNA单链，在复性时并不一定与同源DNA互补链形成双螺旋结构，它也可以与在某些区域有互补序列的异源DNA单链形成双螺旋结构，叫核酸杂交。 四、核酸的变性、复性及杂交 (三) 核酸的杂交 **两条来源不同的核酸单链间，