第16章.同位素示踪在植物病理学研究中应用.pptVIP

3）AFLP（amplification fragment length polymorphism 扩增片段长度多态性） 该方法的基本原理是对基因组DNA的限制性内切酶的酶切片段进行选择性扩增。限制性内切片段与互补粘性末端双链通用人工接头连接，连接后的粘性末端顺序作为以后PCR引物的结合位点,实践中根据需要在引物3’端可分别加入1～3个选择性核苷，以达到选择性扩增的目的。通过标记引入物，?自显影仅显视选择扩增的片段。AFLP 结合了RAPD和RFLP 的优点，具有RFLP技术的可靠和PCR技术的高效性，可在一个反应内检测大量的限制片段，一次可获得50～100条谱带。 AFLP对DNA的纯度和内切酶质要求较高。 4）SSR （micro satellite 微卫星） 指分散在真核生物基因组序列中的2-4个碱基组成的简单重复序列，如（GA）n（GAA）n等。个体间简单重复序列数目的变化产生的多态性，比RFLP多态性高得多，被认为是继RFLP的第二代分子标记，其不足是必须针对每个染色体上的微卫星，发现其两端的单拷贝序列，据此设计引物，这给SSR标记带来方便，尚需进行进一步研究。 5.2 分子标记的 应用 1）分子标记遗传连锁图谱的构建 分子标记图谱是基因定位的基础，标记密度达到0.1cm 时，可直接对基因定位。图谱构建以同源染色体基因交换重组为测度，交换重组率与基因间距离成正比，图谱单位距离厘摩（CM）大致相当于1%重组率。 作图步骤： 建立作图群体 要绘制分子的遗传连续图谱,首先需建立多等位基因分布广泛分离的群体,且群体样本数符合统计要求,常用群体见图。 RFLP 分析 对亲本和作图群体进行RFLP分析。先选择对亲本表现多态性的酶与探针组合（6种酶，100～200个探针），然后对亲本和作图群体进行RFLP分析，根据自显影谱带，分离群体与母本的代型相同记为A，与父本相同记为B，杂合子记为C，缺失或模记为—。 图谱构建 Mapmarer/exp.3.0b 几种作图群体的特点 特点 F2 BC1 BIL DH RIL NIL 形成 F1自交 个体 F1回交 后代 F2自回交 后代 F1花培 F1自交 后代 F1回交自交后代 准确度 低 低 高 高 高 最高 需群体 大 大 小 小 小 小 永久群体 否 否 否 是 是 是 费用 低 低 高 中 中 高 时间 短 短 长 短 长 长 2) QTL定位 数量遗传性状基因座位的定位。因数量遗传效应变化是连续的，常迭加有环境效应，因此一般用统计方法，通过检验某一标记基因型效应的差异是否显及其贡献来确定QTL，最常用的定位方法有方差分析法，（analysis of variance）,区间作图法。 3)种质资源RAPD指纹库 指纹作为研究材料的特征，可用于种质鉴定和分类。指纹库是所有研究个体特异分子标记带的集合，一般由一套引物构建，多态性带构成一个N维空间Rn﹛引1，引2，…﹜，某个体在某一位置有带为1，无带为零，其在空间有确定的位置，对空间进行聚类可进行分类。 4）质量性状标记的定位 选择有差异的材料进行对比分析，可以用近等基因池的原理，把大匹材料按某一性状有无分为二类，各类基因相混合，进行RAPD多态性分析找出特异性条带。 第16章.示踪技术在植物病理学研究中的应用 中国农业大学 齐孟文 第16章.示踪技术在植物病理学研究中的应用 §1 病原微生物的标记 1.1直接法 通过标记培养基而标记病原微生物的方法。将适合的放射性核素或其标记化合物,加入培养基,然后接种病原微生物, 通过培养使其摄取放射性而获得标记,该法仅限于非专性寄生微生物的标记。 方法要点 培养基 适合的普通培养基。 标记核素 常用14C、32P、35S，如14C-葡萄糖，14C-蔗糖， 32P -KH2PO4。 放射性活度 MBq/ml的范围 为了避免刮取菌落时被放射性培养基粘污可用双层培养法。 平板培养时，先在含放射性的培养基上接种培养，待菌落铺满后，再在上面铺上一层非放射性培养基，经过一段时间，菌絲将透过上层培养基，这样获得的标记菌落，可避免放射性培养基污染。 1.2 间接法 对专性寄生菌，如锈菌，白粉菌，病毒等应 先标记寄主，通过寄生关系使病原微生物得到标 记。 1）寄主植物 先标记后接种，用一般植物标记 法进行标记，干组织应具有0.37 ?104 3.7 ?104 Bq/ml。 2）寄主真菌 如以真菌为食料的线虫体,先培养 并标记交链孢霉菌,取得