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一起聚集性肺炎疫情病原快速实验室诊断与分析 　　【摘要】　目的：通过实验室病原学检测，结合流行病学史及临床表现，初步筛查疫情致病病原体。方法：采集患者咽拭子标本，分别采用荧光PCR方法检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、肺炎支原体基因。结果：11份患者咽拭子中有4份标本荧光PCR扩增支原体基因阳性，1份为弱阳性。所有标本的甲、乙型流感荧光PCR扩增结果为阴性。同时采集与患者同班的3例无症状对照标本，3例标本的肺炎支原体DNA检测均为阴性。结论：实验室研究结果并结合此次疫情的流行病学和患儿的临床表现，初步判断可能是一起由肺炎支原体引起的聚集性支原体肺炎疫情。 　　【关键词】　聚集性； 　肺炎； 　肺炎支原体； 　荧光PCR 　　2010年5月4日-6月7日，南京市某小学发生一起以发热、咳嗽、肺炎为临床表现的呼吸道感染疫情，临床表现以发热(100%)、咳嗽(100%)、肺炎(67.77%)为主。首发病例于5月4日发病，医院诊断为急性支气管炎，住院治疗。经10 d左右的治疗，患者痊愈。其余病例发病过程与首发病例情况基本相似。经过对在校学生的流行病学调查结合实验室研究和讨论，初步推断此次疫情的病原体为肺炎支原体。肺炎支原体在自然界分布广泛，是引起人类急性下呼吸道感染和肺炎的常见病原体，也是呼吸道感染暴发流行的常见原因。欧洲10 个国家的26个前瞻性研究组调查了社区获得性肺炎(CAP)5961例，肺炎支原体感染的发病率占第4位。肺炎支原体感染多数起病较慢，以咳嗽、发热为主要症状，部分患者有类似上感症状，半数可闻及干湿性啰音[1]。肺炎支原体感染的症状、体征及胸部 X线缺乏特异性，确诊需依靠病原学检查[2]。本实验室用荧光聚合酶链反应对11例病例标本及3例对照标本进行快速诊断，现报告如下。 　　1　材料与方法 　　1.1　患者样本　2010年6月4日、6月7日，分两批对出现上呼吸道感染症状的学生采集咽拭子11份，同时进行肺炎支原体病原学和流感病原学检测。同时采集3份对照标本。 　　1.2　肺炎支原体荧光PCR检测 　　1.2.1　肺炎支原体DNA提取　将hank’s液中浸泡的棉签反复震荡挤压，弃棉签，将剩余液体倒入离心管中，以12 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入50 μl DNA提取液(中山大学达安基因股份有限公司)充分混匀，沸水浴10 min，12 000 r/min离心5 min后取上清(DNA)备用。 　　1.2.2　荧光PCR扩增　采用 MP核酸定量检测试剂盒 ( PCR荧光探针法，中山大学达安基因股份有限公司生产)对DNA标本进行检测，按试剂盒说明操作及判定结果。仪器采用美国应用生物系统公司(App lied Biosystems) 7500 fast定量PCR仪。通过软件判断阴性、阳性。 　　1.3　流感病毒核酸检测　甲型流感核酸扩增引物Flu-A-Forward: 5’-GACCRATCCTGTCA CCTCTGAC-3’；FluA-Reverse:5’-GGGCATTYTGGACAAAKCGTCTACG-3’；FluA-probe: 　　5’-(FAM)-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-3’。乙型流感核酸 　　扩增引物 Flu B-Forward:5’-TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG-3’；FluB-Reverse: 5’-CGGTGCTCTTGACCAAATTGG-3’；FluB-Probe: 5’-CCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGGTG-3’。上述引物由江苏省疾病预防控制中心提供。病毒RNA提取采用组织RNA全自动萃取试剂(台湾台塑公司)，于核酸提取仪(台湾台塑公司，SuperPure System-32 )上操作。RT-PCR扩增采用德国 Qiagen公司的QuantiTect Probe RT-PCR Kit试剂盒。扩增条件：50 ℃ 30 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 　　1 min，5个循环；95 ℃ 10 s，55 ℃ 40 s，40个循环。上7500 fast定量 PCR仪检测。通过软件判断阴性、阳性。 　　2　结果 　　2.1　流感病原学检测结果　11例有症状病例，3例对照咽拭子进行甲型和乙型流感病毒RNA荧光PCR检测，检测结果全为阴性。 　　2.2　肺炎支原体病原学检测结果　11份有症状病例咽拭子中肺炎支原体DNA阳性4份，弱阳性1份。3例对照样本中肺炎支原体DNA均为阴性。 　　3　讨论 　　3.1　2003年SARS过后政府各部门高度重视公共卫生突发事件，而实验室为突发事件尽可能快地排查可疑病原体起到尤为重要的作用。针对此次疫情发生的情况，结合临床表现和现场流行病学调查，实验室主要