苦瓜DNA提取方法比较.doc

苦瓜DNA提取方法比较 　　摘要：采用ＣＴＡＢ法、ＳＤＳ法、ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法、试剂盒法４种方法提取苦瓜（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ Ｌ．）叶片基因组ＤＮＡ，并使用分光光度法和琼脂糖凝胶电泳检测提取所得ＤＮＡ的纯度和浓度。结果表明，ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法和试剂盒法提取的基因组ＤＮＡ纯度高于ＣＴＡＢ法和ＳＤＳ法，其中ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法提取的ＤＮＡ浓度和产率高于其他方法。 　　关键词：苦瓜（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ Ｌ．）；ＤＮＡ提取；ＣＴＡＢ法；ＳＤＳ法；ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法；试剂盒法 　　中图分类号：Ｓ６４２．５；Ｑ５２３ 文献标识码：Ａ 文章编号：0439－８114（２０12）17－3866-03 　　Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ Ｌ． 　　ＸＵ Ｙａｎ－ｊｕｎ，ＬＩＵ Ｙａｎｇ 　　（Agricultural Ｃｏｌｌｅｇｅ, Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５， Ｃｈｉｎａ） 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ， ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ， ＳＤＳ-ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｔｏｔａｌ ＤＮＡ ｆｒｏｍ Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ Ｌ． Ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ＳＤＳ-ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ＳＤＳ-ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｏｔｈｅｒ ｍｅｔｈｏ??ｓ． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ Ｌ．； ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ； ＳＤＳ ｍｅｔｈｏｄ； ＳＤＳ-ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ； ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄ 　　ＤＮＡ的提取质量是分子生物学研究的前提，通常要求所提取的ＤＮＡ有较高的纯度，完整且无断裂、无降解，提取过程尽量少使用有毒化学品等［１，２］。植物的种类、采样部位、采样时期等都会对ＤＮＡ的提取效果造成影响［３－８］。本研究以苦瓜（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ Ｌ．）为材料，使用ＳＤＳ法、ＣＴＡＢ法、ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法和试剂盒法提取基因组ＤＮＡ，并对提取效果进行比较分析，以筛选出ＤＮＡ纯度和产率都较高的提取方法，为苦瓜分子生物学的研究提供技术支持。 　　１ 材料与方法 　　１．１ 实验材料 　　供试苦瓜品种为碧翠苦瓜，种植于贵州大学农场大棚，采集盛花期苦瓜幼嫩叶片，使用变色硅胶干燥后备用。 　　试剂ＣＴＡＢ、ＳＤＳ、Ｔｒｉｓ、ＰＶＰ、琼脂糖等购于Ｓｉｇｍａ公司；ＥＤＴＡ、氯化钠、氯仿、异戊醇、硼酸、乙酸钾、乙酸钠、５×ＴＢＥ、１×ＴＥ等购自生工生物工程（上海）有限公司；ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、ＲＮＡｓｅ购于天根生化科技（北京）有限公司；试剂盒Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ购于宝生物工程（大连）有限公司。 　　１．２ 苦瓜ＤＮＡ的提取 　　１．２．１ ＳＤＳ－ＣＴＡＢ法 ①称取０．２ ｇ干燥的苦瓜嫩叶，加入２％的ＰＶＰ和少量的石英砂，液氮充分研磨。②将研磨成均匀粉状的材料加入到７００ μＬ ２％ ＳＤＳ提取液（１００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１．４ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、２％ＳＤＳ、２％ＰＶＰ，ｐＨ ８．０）中，并加入１００ μＬ β－巯基乙醇，振荡混匀，于６５ ℃水浴１ ｈ，期间每隔１０ ｍｉｎ上下颠倒离心管。③取出冷却至室温，加入０．８倍体积的５ ｍｏｌ／Ｌ ＫＡｃ（ｐＨ ４．８），０ ℃冰浴１ ｈ，在４ ℃下１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，取上清。④加入０．４倍体积的２％ ＣＴＡＢ提取液（１００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、 １．４ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、２０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、 ２％ ＣＴＡＢ、２％ ＰＶＰ，ｐＨ ８．０），充分混匀，６５ ℃水浴２０ ｍｉｍ。⑤冷却至室温后加入等体积的氯仿-异戊醇（体积比２４∶１，下同）抽提３次，４ ℃、１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离