细胞与分子生物学技术2 细胞样品RNA的抽提逆录及实时定量PCR测定.pptxVIP

细胞样品RNA的抽提、逆转录(RT)及实时定量PCR（qPCR）测定;量很少，需要进行PCR扩增，便于检测;提纲;PCR概念;PCR 循环;很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖， Mullis是其中之一.;;PCR的发明;PCR的发展史;;;在现实的实验中，由于酶，dNTPs，引物，模板等因素，扩增效率达不到100% ; DNA模板 引物 反应缓冲液 Mg 2＋ dNTP ddH2O 耐热聚合酶;;;产 品 类 型;;PCR具有极高的灵敏度;PCR常见问题;PCR常见问题之一;PCR常见问题之二; ;PCR常见问题之三; ;PCR常见问题之四; 巢式PCR（Nest-PCR） ;策略之一;策略之二;策略之三;策略之四;常规PCR;常规PCR;提纲;QUANTITATION OF mRNA northern blotting ribonuclease protection assay in situ hybridization PCR;Why we need Real time PCR?;Why we need Real time PCR?;;Why we need Real time PCR?;定量PCR;定量PCR ;PCR反应混合物;荧光曲线;定量原理;定量原理;Ct值的概念;浓度低;为什么要用Ct值定量;;阈值选择;定量原理;;Absolute（绝对定量） Determines input quantity of a nucleic acid target Requires a standard curve Relative（相对定量） Determines fold differences in input target nucleic acid quantities between samples Performed with or without a standard curve Typically used for gene expression analysis with a target gene normalized to a reference gene; 定量原理：利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线，通过未知样品的Ct值，从标准曲线上计算出该样品的起始浓度。 ;首先确定未知样品的 C(t)值 借助标准曲线由未知样品的C(t)值反推出其初始量 得到未知样品初始量绝对值;Livak Comparative Ct Method (2-DDCt) for Relative Quantification;Quantities interpolated from standard curves are used to measure fold differences in target nucleic acid At least 2 concurrent standard curves are used One for gene(s) of interest At least one for reference gene Standard curves account for reaction efficiencies ;与传统PCR的比较;提纲;Fluorescent Chemistry Choices; SYBR Green 1;SYBR Green I;SYBR Green I 工作原理;SYBR Green I 工作原理;SYBR Green I 优点;SYBR Green I 缺点;关于SYBR Green I;Molecular  Beacons;Molecular Beacons;Target-loop interaction more stable than stem-stem;延伸: 没有荧光;Molecular Beacons 优点;Molecular Beacons缺点;TaqMan;TaqMan;;;TaqMan优点;TaqMan缺点;Each method has advantages and disadvantages???;兼容化学试剂总结;提纲;多重PCR;内参照基因;多通道技术; 1、引物及探针问题---引物及探针的相互干扰 2、不同PCR反应要在同样扩增条件下进行 2、模板量差别---共用资源的相互竞争;F;F;单双通道同时进行，相互验证;提纲;表达差异;提纲;Temperature increases;荧光强度值随温度变化速率对温度作图(-dI/dT);SYBR Green I 融解曲线分析; 进行可靠的定量实验需要对引物对进行优化设计 用于优化扩增产物产量和特异性的参数 引物设计 扩增片段选择 试剂的浓