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免疫球蛋白的纯化与测定 QAE-Sephdex A50离子交换层析法分离纯化人血清IgG 洪晓武 2014-11-12 蛋白质的两性电离 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 蛋白质的等电点( isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。 蛋白质的分离纯化方法 透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。 丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 *丙酮沉淀: 低温进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。 *盐析(salt precipitation)：将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 *免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。 电 泳 蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。 几种重要的蛋白质电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS) 。 层析(chromatography) 原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。 层析的主要设备 自动分步收集器 离子交换层析(ion exchange chromatography) 离子交换层析法是利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。电荷不同的蛋白质，对管柱上的离子交换剂有不同的亲和力，改变冲洗液的离子强度和pH值，物质就能依次从层析柱中分离出来。 离子交换操作方法 树脂预处理 离子交换吸附 洗脱 实验室 蛋白质的紫外吸收 由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。 免疫球蛋白的纯化与测定 QAE-Sephdex A50离子交换层析法分离纯化人血清 IgG IgG是血清主要的抗体成分。 IgG的功能作用主要在机体免疫中起保护作用，大多数抗菌、抗病毒；应对麻疹、甲型肝炎等，能有效地预防相应的感染性疾病。 原理 QAE-Sephdex A50特点 强碱性阴离子交换剂 可以再生 交换容量大 血清中的γ球蛋白属于中性蛋白，其余均属酸性蛋白。 QAE-Sephdex A50可以很好地和酸性蛋白吸附 材料 Buffer A 0.1M乙二铵-醋酸buffer（PH7.0） Buffer B 0.075M醋酸铵-醋酸buffer （PH4.0） QAE-Sephdex A50 正常人血清 玻璃层析柱等 方法 QAE-Sephdex A50预处理 QAE-Sephdex A50 1g Add 80ml buffer A and mix gently, 30-60m Repeat the above steps 2 times QAE-Sephdex A50预处理 将1g QAE-Sephadex A50置于玻璃烧杯中，加入80ml bufferA。 浸泡30-60m，并不时轻轻搅拌，使交换剂体积逐渐膨胀，体积可达30ml。 去除上清液及悬浮于上层的微细颗粒，再加入80ml bufferA. 重复上述步骤2次 Colume installation, equilibration, loading and elution and collection A50 bufferA serum BufferA installation equilibration Loading sample Elution and collection 安装及平衡 将柱垂直安装在铁架上，用滴管取少许buffer A沿管壁加入层析柱中，拧松胶管夹，使buuferA在距柱下4—5cm时，关闭胶管夹。 将预处理过的凝胶沿管壁倒入层析柱中，注意避免气泡产生。在沿管壁加入部分bufferA 待凝胶有部分沉淀时，松开胶管夹，使液体缓慢流出 收集液体（300ml），检测流出液PH值，如与bufferA相同，表明层析柱已经平衡好 加样 将正常人