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第五章食品生物技术实验 实验55 脉胞菌固体发酵β-生产胡萝卜素 实验目的 了解脉孢菌生长特性; 学习胡萝卜素固态发酵生产工艺。 实验原理 β-胡萝卜素（β-Carotene）是共轭双键化合物，分子式为C40H56，分子量为536.88，熔点176-180℃，β-胡萝卜素的晶体是深红紫至暗红色有光泽的斜六面体，稀溶液呈橙黄色至黄色。遇氧、热及光不稳定，在弱碱下较稳定，是一种脂溶性色素，属于类胡萝卜素的一种。广泛存在于植物、藻类和真菌中，动物和人体内不能合成必须从外界摄入。β-胡萝卜素有各种顺反不同的立体构型，全反式的结构如图1 所示。 国内外生产β- 胡萝卜素可通过化学合成、植物提取和微生物发酵等3种方法。微生物（真菌、细菌和藻类）发酵法生产β-胡萝卜素，从品质、技术、资源和成本等因素考虑优于上述两种方法，未来此方法 ⑴ 菌种：脉孢菌（Neurospora sitophila ）。 ⑵ 仪器、装置：紫外可见分光光度计、高速离心机、净化工作台、康氏震荡器、霉菌培养箱、发酵曲盘、三角瓶。 ⑶ 试剂：β- 胡萝卜素标样、盐酸、丙酮。 ⑷ 培养基及其制备： ① 种子培养基：查氏培养基。 ② 发酵培养基： 基础培养基(100g)：豆渣85%，麸皮添加量15%，培养基含水量为77-80%，PH自然。 添加发酵前体培养基（100g）：豆渣85%，麸皮添加量15%，培养基含水量为77-80%，添加番茄汁（浓度2%）5mL，PH自然。 ⑷ 实验流程： 4．实验步骤及方法 ⑴ 种子培养： 将活化完成的脉孢菌制成孢子菌悬液，转接到三角瓶直接进行发酵，或转接到三角瓶作为种曲进行扩大培养后，再转接到曲盘中进行发酵生产β-胡萝卜素。 取3只500mL三角瓶，装入发酵培养基⑵ 发酵培养： 发酵采用曲盘发酵，曲盘规格是（32×15×2.8cm）。曲盘）500g。 将发酵后的三角瓶种子，按照10%的接种量均匀地接入曲盘中，接种后曲盘中的发酵培养基尽量平整，并在曲盘⑶ β-胡萝卜素的提取： 脉孢菌固态发酵生产β-胡萝卜素，其产物存在于孢子中，故提取必须经过破壁处理。实验采用热酸破壁法。 ①β-胡萝卜素的破壁和提取的原理： 脉孢菌的孢子壁结构组成成分大致与其细胞壁相同，都是由几丁质和葡聚糖等构成而形成紧密的网状结构。利用盐酸对孢子壁中的某些多糖与蛋白质成分作用，破坏网状的共价键，使得原来结构紧密的孢壁变得疏松，再经过沸水浴和骤冷处理，孢壁结构得以破坏，孢内物质溶出，便于提取。 β胡萝卜素是脂溶性的色素，需用有机溶剂来提取。而它在丙酮中溶解度较大，而丙酮具有低毒、低沸点以及具有较强的挥发性，所以，丙酮是较好的提取剂。 ②破壁及提取的方法： 精确称取0.500g干燥（干燥温度45oC）后的发酵基质，于50ml三角瓶中，加入15mL HCL（3mol/L），在常温下避光放置振荡器上振荡1h。沸水浴3-4min，迅速冷却。将破壁好的孢子悬液，转入离心管中，进行离心（5000r/min）10min，弃去上清液，加入适量的蒸馏水搅拌水洗后，，再进行离心（5000r/min）10min，弃上清液，重复水洗、离心一次。 将完成离心的提取物中加入15ml丙酮，充分搅拌使得β-胡萝卜素迅速扩散进入丙酮相中，然后离心（5000r/min）⑴ β-胡萝卜素标准曲线的绘制： ①.标准溶液的配制： 精取0.0100g β-胡萝卜素标准样品，放入10ml比色管中，用丙酮定容至满刻度。用移液管移取5ml该溶液，转入100ml容量瓶中，然后，用丙酮定容至满刻度，则该溶液中β胡萝卜素的浓度即为50μg/ml。 ②.标准曲线的绘制： 取6支比色管（10±0.1ml，最小刻度为0.5ml）,依次移取标准溶液0.00ml、1.00ml、3.00ml、5.00ml、7.00ml、9.00ml，摇匀后，用蒸馏水稀释至10ml，此时的溶液分别相当于β-胡萝卜素浓度为（μg/ml）：0.00、5.00、15.00、25.00、35.00、45.00。然后在450nm下用紫外分光光度计分别测定吸光值，根据数据列表拟合标准曲线。 ③提取得率计算： 发酵基质提取得率可由以下公式计算得出。 ④注意事项 β-胡萝卜素对光、热、氧气、酸不稳定，故在操作过程中，应尽量避开这些不稳定因素。 .6. 实验结果与讨论 将不同发酵培养基的基质进行β-胡萝卜素测定，实验结果添入下表，比较两种不同发酵培养基中产物的得率。 表1比较不同发酵培养基中β-胡萝卜素得率 基础培养基 添加发酵前体培养基 序号 1 2 3 1 2 3 β-胡萝卜素（ug／g）* β- 胡萝卜素生产方法研究进展唐玲1等食品研究与开发2009 年1 月第30 卷第1 期169-171 预习与思考 5