无乳链球菌GlnR因子DNA结合位点预测及其突变基因构建.docVIP

无乳链球菌GlnR因子DNA结合位点预测及其突变基因构建 　　摘要：利用生物信息学的方法对无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）GlnR因子与DNA结合的位点进行预测，筛选出GlnR因子中与DNA结合的关键位点的氨基酸残基R47和R48。然后利用重叠PCR的方法将glnR基因上的第139～144位上的碱基CGCCGC突变为GCGGCG，使其编码的2个精氨酸残基突变为丙氨酸残基，将突变基因片段TA克隆至PMD18-T载体上进行测序验证。测序结果表明，利用重叠PCR成功突变了这6个碱基，为后续研究GlnR因子的突变位点对DNA结合的影响提供了参考。 　　关键词：无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）；glnR；DNA结合位点；重叠PCR；生物信息学 　　中图分类号：R378.1+2；Q-33 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）23-5902-04 　　DNA与蛋白质相互作用的研究是21世纪生命科学研究的重要方向之一，阐明DNA与蛋白质相互作用的机制，对了解DNA转录调控和基因表达机制，揭示各种生命活动现象具有重要的指导作用[1]。在分子生物学和信息科学快速发展的影响下，生物信息学在生物研究领域中的指导性作用越来越大。生物信息学在预测蛋白质与DNA相互作用的结合位点方面与其他方法相比，可缩短研究蛋白质与DNA相互作用所需的时间[2]，达到事半功倍的效果。Wang等[3]提供了一项名为BindN的网络服务（http：///bindrt/），该工具利用支持向量机（Support vector machine，SVM）通过侧链pKa值、疏水指数和氨基酸的分子质量这3个特征值来预测可能的结合位点的残基。 　　GlnR是一种全局性转录调控因子，属于MerR家族，参与多种代谢酶的合成、次级代谢以及转运相关基因的表达调控[4，5]。其中GlnR在氮源代谢调节过程中起重要作用，并通过调节氮源代谢与多种细菌的致病性密切相关[6]。近年来，随着罗非鱼“突眼病”的暴发，无乳链球菌作为罗非鱼的主要致病菌也越来越多被关注和研究。作为一类重要的致病相关因子，目前还未见到有关无乳链球菌GlnR因子的相关报道。 　　本研究以罗非鱼无乳链球菌GlnR因子为研究对象，通过基于BindN的网络服务预测无乳链球菌GlnR因子中可能参与DNA结合的氨基酸残基，通过分析这些氨基酸残基筛选出最具可能性的结合位点，并利用重??PCR技术扩增GlnR突变基因，为后续研究GlnR因子与DNA的相互作用机制提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 GlnR因子与DNA结合位点的预测 　　在本实验室前期的工作中，已克隆了罗非鱼源[a1]无乳链球菌yzf707的glnR基因，GenBank登陆号为JQ013525。本研究将此基因编码的氨基酸序列提交至BindN网络服务器中，预测该蛋白中参与DNA结合的氨基酸残基位点。 　　1.2 供试菌株和试剂 　　2012年于广西工学院生物化工实验室进行试验。无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、大肠杆菌（Escherich coli） JM109由广西工学院发酵工程研究室保存。质粒小提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，TA克隆试剂盒、Ex Taq酶购自宝生物工程有限公司。 　　1.3 试验方法 　　1.3.1 引物设计 根据无乳链球菌的glnR基因序列，设计2对引物，在139～144位上引入突变碱基GCGGCG，并由上海英骏生物技术有限公司合成。引物序列见表1。 　　1.3.2 glnR基因定点突变 利用重叠PCR的方法对glnR基因进行定点突变，反应原理见图1。 　　第一步PCR分别以P1和P2扩增上游片段M1，P3和P4扩增下游片段M2。50 μL体系中加入10×PCR buffer 5 μL、模板1 μL、dNTP 4 μL、引物各1 μL、Ex Taq酶0.25 μL，添加ddH2O至50 μL。以培养12 h的无乳链球菌菌液为模板。 　　其中合成基因片段M1的反应参数为：94 ℃预变性 10 min后，94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环后，72 ℃延伸10 min。合成基因片段M2的反应参数为：94 ℃预变性 10 min后，94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25个循环后，72 ℃延伸10 min。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切割含有目的条带的凝胶块，利用凝胶回收试剂盒进行目的片段（M1、M2）回收。 　　第二步PCR以P1和P4为引物，以胶回收后的M1和M2为模板。50 μL体系中加入10×PCR b