宫颈DNA定量分析技术中IOD值偏低原因探讨.docVIP

宫颈DNA定量分析技术中IOD值偏低原因探讨 　　【摘 要】目的：探讨宫颈DNA定量分析技术中IOD值偏低的常见原因及应对措施。 方法：宫颈DNA定量分析技术中的Feulgen染色是一种多步骤、多因素影响的染色方法，很多因素可能会干扰染色结果造成IOD值偏低，从而影响DNA定量分析结果的判读。 结果：提高DNA定量分析技术中Feulgen染色技术，帮助提高DNA定量分析结果判读的准确性。 结论：通过对宫颈DNA定量分析技术中IOD值偏低的原因及应对措施进行探讨，Feulgen染色结果得到显著提高，同时也提高了结果判读的准确性。 　　【关键词】 DNA定量分析技术，Feulgen染色，IOD值 　　【中图分类号】R73 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2013）04-0542-02 　　宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，因此寻找简便、可靠、安全的宫颈癌前病变早期筛查方法是一项迫切而重要的任务。当致癌因素早期作用于细胞时，细胞核内DNA结构和含量发生改变，最终发展为细胞形态异常和恶性增殖。而DNA定量分析技术可通过全自动高分辨率细胞DNA图像定量分析仪对细胞核的上百项参数进行扫描分析，测量早期细胞核内DNA含量的变化，在形态改变不明显前即检测出病变细胞，实现癌及癌前病变的早期诊断，并且具有准确、客观、重复性好的特点[1]。宫颈DNA定量分析技术中的染色技术为Feulgen染色，它是一种多步骤、多因素影响的染色方法[2]，很多因素可能会干扰染色结果从而引起IOD值偏低，进而影响DNA定量分析结果的判读。为了制作出优良的诊断切片，提高宫颈癌筛查的准确性，作者回顾了近年来所进行的宫颈DNA定量分析制片染色技术，现将造成IDO值偏低的常见原因及体会介绍如下。 　　1.温度 　　Feulgen染色的基本原理[3]是利用盐酸在一定温度下将DNA分子水解，第一步从DNA的脱氧核糖核酸残基分解出碱基，第二步在脱氧核糖核酸残基的第1～4位碳键处打断糖苷键而游离出醛基，游离出来的醛基即与Feulgen液结合把DNA显示出来。因此温度的控制非常重要，推荐的染色温度为25±2℃，如果温度过低会使游离出的醛基减少同时会造成已经溶解的染色剂由于低温而析出，不能有效的与醛基结合，降低染色效果，引起IOD值偏低。因此酸解和染色过程应在恒温箱中完成，最好在恒温箱放置一根温度计，以监测温度是否在23～27℃的有效范围内。有条件的实验室可以配备空调，让室温维持在25℃左右。 　　2.盐酸浓度及酸解时间 　　盐酸水解DNA的过程就是醛基暴露的过程，醛基暴露的量与盐酸浓度及酸解时间相关，在一定范围内成正比，但过度酸解会使DNA链断裂而流失到胞质中。研究显示DNA酸解过程可分为四期[4，5]：①上升期，此期醛基的数量随着盐酸浓度升高和酸解时间延长而增加；②高峰期，此期醛基数量达到最高；③平台期，此期由酸解产生的醛基数量与酸解导致DNA断裂流失到胞质中醛基减少的数量相对平衡，醛基数量维持在一个比较高的动态水平；④消退期，随着时间延长，DNA断裂增加，醛基流失速度大于醛基产生的速度，使醛基数量逐渐减少。平台期暴露的醛基数量稳定，是Feulgen染液反应的适宜阶段。如果提高盐酸浓度可以使DNA酸解变快，但平台期时间维持过短，不利于染色的操作；反之降低盐酸浓度会使DNA酸解延长，这样染色效率过低。另外，酸解时间过短，醛基暴露数量不够；酸解时间过长，醛基可能进入消退期而丢失，所以酸解时间控制不当常引起IOD值偏低。5mol/L的盐酸酸解60分钟，既可以保证足够的平台期时间让我们进行染色，同时又兼顾了染色的效率并且能使IOD值维持在正常范围内而不会偏低。 　　3.微生物感染 　　作者在一次宫颈DNA定量分析制片中发现，同一批次制作的切片有一张IOD值很低，无法对结果进行有效判读，后来对这个标本保存液剩余的细胞进行再次制片时依然存在IOD值偏低的情况。于是仔细回忆制片过程中的操作步骤、温度、盐酸浓度及酸解时间等情况均未出现问题，那为何这张切片IOD值会偏低呢？最后我们利用这个标本进行薄层液基细胞制片时发现，显微镜内有大量的线索细胞出现，提示微生物感染。女性宫颈特异性微生物的感染率为12.6%～15.1%[6]，常见的有阴道球杆菌、白色念珠菌、滴虫等。这些微生物感染可以引起宫颈细胞水肿变性甚至溶解，从而使细胞核着色变浅IOD值偏低。 　　综上所述，Feulgen染色是宫颈DNA定量分析技术中的核心步骤之一，染色不良导致IOD值偏低会直接影响结果判读（容易出现假阴性），当IOD值低于90（IOD正常值为100～140）则判为不满意标本，需要重新制片或取材。因此当出现IOD值偏低的情况，需在排查实验操作步骤错漏、试剂质量问题等情况下重点检查温度、盐酸浓