仙茅及其有效成分对不同状态L02细胞PXR—CYP3A影响研究.docVIP

仙茅及其有效成分对不同状态L02细胞PXR—CYP3A影响研究 　　[摘要] 目的：明确仙茅水提液及其有效成分苔黑酚葡萄糖苷对正常、虚寒状态L02细胞中PXR-CYP3A的影响，为探讨仙茅在不同状态下药效表达差异的机制奠定基础。方法：分别用正常、虚寒大鼠血清培养L02细胞，诱导正常、虚寒2种状态细胞。仙茅水提液及其有效成分苔黑酚葡萄糖苷作用于不同状态细胞后，检测不同状态L02细胞PXR蛋白表达和CYP3A活性。结果：MTT法结果显示，仙茅水提液和苔黑酚葡萄糖苷能使L02细胞活力明显增强；仙茅水提液能使正常组L02细胞PXR蛋白表达水平显著降低，苔黑酚葡萄糖苷能使正常组L02细胞CYP3A活性和PXR蛋白表达水平均显著降低；而仙茅水提液能使虚寒组L02细胞CYP3A活性和PXR蛋白表达升高，苔黑酚葡萄糖苷能使虚寒组L02细胞CYP3A活性水平显著降低，使虚寒组细胞PXR蛋白表达水平升高。结论：仙茅作用于虚寒状态L02细胞，能激活PXR诱导CYP3A活性，但对正常L02细胞的PXR及其介导的CYP3A活性没影响或作用相反。 　　[关键词]仙茅；有效成分；L02细胞；孕烷X受体；药物代谢酶CYP3A 　　孕烷X受体（pregnane X receptor，PXR）是核受体亚家族的主要成员之一，因为能被多种天然的或合成的孕激素所激活而得名。PXR对机体内环境的稳态起着重要调节作用，并对多种药物代谢酶、转运体及其他基因表达有调控作用。CYP3A是影响药物体内过程的重要代谢酶，PXR对CYP3A的调控受到了学者们的高度关注。随着人们对中草药研究的不断深入，中药或其成分对PXR-CYP3A的影响研究不断增多[1-5]。但从体外细胞水平研究中药或其有效成分对PXR和CYP3A的影响少见，特别是对不同状态细胞的影响尚未见报道。本实验排除机体复杂因素影响，将仙茅水提液及其有效成分苔黑酚葡萄糖苷分别作用于正常和虚寒状态L02细胞，观察仙茅水提液及其有效成分苔黑酚葡萄糖苷对不同状态L02细胞PXR及其介导的CYP3A变化的影响，从体外实验探讨仙茅药效表达机制。 　　1材料 　　1.1动物与细胞 雄性SD大鼠，体重（240±10） g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号SCXK（京）2007-0001。L02细胞：即正常人肝细胞，由北京中医药大学中药学院生物技术系王春梅老师惠赠。 　　1.2药物和试剂 仙茅药材和苔黑酚葡萄糖苷对照品由北京中医药大学中药分析系的黄建梅教授提供，苔黑酚葡萄糖苷对照品纯度95%。注射用氢化可的松琥珀酸钠（天津生物化学制药有限公司，批。RPMI Medium 1640 培养基（31800-014）、胰酶、胎牛血清（美国GIBCO公司）；台盼蓝、MTT（美国Sigma公司）；红霉素、还原型辅酶Ⅱ（NADPH）生成系统（包括NADP，6-磷酸葡萄糖二钠，6-磷酸葡萄糖脱氢酶）为Sigma产品；牛血清蛋白（北京邦定泰克生物技术公司）。丙烯酰胺（电泳级）、双丙烯酰胺（N-N′-甲叉双丙烯酰胺）、过硫酸胺、聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯即吐温-20（Amresco）；Tris，Base[三（羟甲基）氨基甲烷]，SDS（十二烷基磺酸钠）（Sigma公司）；TEMED（Aldrich）；甘氨酸（Glycine，北京拜耳迪生物公司）；2-巯基乙醇、Triton X-100（Topbio）；PMSF、丽春红（北京生科泰园）；NC膜（Amersham Biosciences）；Μltra ECL底物化学发光检测试剂盒（北京博迈德科技发展有限公司）；PXR（H-160）：sc-25381 Antibod，SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY；HRP Conjugated Goat Anti-rabbit IgG（h+1）：GGHL-15P，Immunology Consultants Laboratory；ACTB MonoClonal Antibody （mouse），Protein tech Group；HRP-Goat Anti-Mouse IgG（H+L），Protein tech Group。 　　1.3仪器 CO2细胞培养箱（美国Napco公司）；超净工作台（天津医药净化设备厂）；YG500圆筒型不锈钢过滤器；Nikon生物显微镜（日本）；SHIMADZU UV-120-02紫外-可见分光光度计（型号752，上海光谱仪器有限公司）；LXJ-Ⅱ离心机（上海医用分析仪器厂）；EB-280-22电子精密天平（日本CORPORATION公司）； DIAX900型内切式匀浆器（德国Hei dolph公司）；电泳仪、Trans-Blot转印槽（BIO-RAD公司）；移液器（Eppendor