蜂毒素诱导人Bel―7402细胞株恶性表型转化实验研究.docVIP

蜂毒素诱导人Bel―7402细胞株恶性表型转化实验研究 　　【摘要】 目的 观察蜂毒素处理人Bel-7402细胞株后对其恶性表达行为的影响。方法 浓度为2μg/ml和4μg/ml两个实验组，以全反式维甲酸作为阳性对照，从细胞增殖的抑制、ConA凝集及克隆形成能力、甲胎蛋白含量、c-myc基因表达等方面进行观察。结果 2μg/ml和4μg/ml蜂毒素均能抑制Bel-7402细胞株的增殖；蜂毒素处理后的细胞凝集及克隆集落形成能力降低；甲胎蛋白含量下降； c-myc基因表达显著降低。结论 低剂量蜂毒素能有效诱导人Bel-7402细胞株恶性细胞生物学行为的转化。 　　【关键词】 蜂毒素；人Bel-7402细胞株；恶性表型；逆转；诱导 　　【中图分类号】R2-031 【文献标识码】A 【文章编号】1004-4949（2013）06-39-03 　　恶性肿瘤是危害人类健康的严重疾病之一，普遍观点认为，肿瘤细胞是从正常细胞转化成的不受控制地无限增殖的细胞[1]。正常细胞的分化是有序、有限和有选择的基因表达，而肿瘤细胞出现分化缺失、阻断和异常，可以说，肿瘤就是一种细胞增殖和分化异常的疾病[2]。通过物理、化学或分子生物学的方法，“诱导分化”和/或“诱导逆转”逐渐成为肿瘤研究领域的热点。蜂毒素（Melittin）是蜜蜂毒的主要成分，为26个氨基酸组成的碱性多肽，生物活性高，对多种肿瘤细胞有杀伤作用[3-4]。本研究拟观察低剂量蜂毒素处理人肝癌细胞后对细胞恶性表型的影响，初步探讨其抑制肿瘤细胞作用可能的发生环节。 　　1 材料 　　1.1 试剂与药品： 蜂毒素为本科实验室采用凝胶色谱法纯化制备（纯度97%）；全反式维甲酸（ATRA）、四甲基偶氮唑蓝（MTT）为美国Sigma公司产品； RPMI-1640培养基为美国Gibco公司产品；刀豆蛋白（ConA）为上海华舜生物公司提供；甲胎蛋白单克隆抗体酶免检测试剂盒为瑞典CanAg公司产品；C-myc基因一抗为Santa Cruz公司产品。 　　1.2 细胞株： 人肝癌Bel-7402细胞株引自中国科学院上海细胞研究所，由长海医院中医科保存，常规接种于含100ml/L小牛血清的RPMI-1640完全培养基中，在37℃，50 ml/L CO2饱和湿度条件下培养，取生长期细胞进行实验。 　　2 方法 　　2.1 细胞增殖抑制及生长曲线： 将人Bel-7402细胞以1×105/ml接种于24孔板中，24 h细胞贴壁后，分别加入浓度为2μg/ml和4μg/ml的蜂毒素，阳性对照为10μmol/l的全反式维甲酸，阴性对照组加入等体积RPMI-1640培养基，每个组别24孔×2板，于处理后取7个时间作用点（12h、24h、48h、72h、96h、120h、144h）及1天-8天时，每个浓度各取3孔，用血细胞计数板，光镜下计数活细胞数，计算抑制率。 　　2.2 刀豆蛋白（ConA）凝集试验： 取相应处理组细胞，稀释至浓度为1×105/ml，取无菌96孔板，按相应组别，分别向各孔中加入单细胞悬液100μl；再加入不同浓度（100、50、20、10、5μg/ml）的刀豆蛋白A（ConA）溶液；置37℃环境中，振荡器上振荡15min，倒置显微镜下观察凝集情况。 　　2.3 平皿克隆形成试验： 取生长良好的Bel-7402细胞，稀释成200个/ml.接种在24孔无菌培养板中，每孔0.9ml，每组设3个平行对照，待细胞贴壁后，加入相应药物，阴性对照加等体积PBS，继续培养10天后作克隆计数，每50个细胞为一个克隆并照相。克隆形成抑制率=（对照组克隆数-实验组克隆数/对照组克隆数）×100%。 　　2.4 甲胎蛋白含量测定： 取生长状态良好的Bel-7402，稀释后加于无菌200ml培养瓶中， 24 h细胞贴壁后，给予相应药物及对照处理，于第1、3、5、7日收集培养液，真空冷冻干燥，检测时溶于等体积PBS中。按照甲胎蛋白（AFP）检测试剂盒的操作要求，以酶联免疫检测仪，检测波长在450nm颜色吸光度，产生的颜色深度与标本中AFP的量呈正比。 　　2.5 c-myc基因表达： 无菌6孔板内置载玻片，贴壁后给予相应药物处理，每组取3片，培养5天后，95%乙醇固定。在固定好的细胞爬片上依次加入1：100稀释的鼠抗人c-myc单克隆抗，生物素标记的二抗，辣根过氧化物酶标记的链霉卵蛋白共同孵育，DAB显色剂室温显色，乙醇脱水后封片，200倍光学显微镜下观察。 　　2.6 统计学处理： 数据用x±s表示，SPSS 17.0统计软件进行分析，经过方差齐性检验后，方差齐性采用单因素方差分析 （One-way ANOVA）、多重比较采用 LSD法，计数资料进行描述性分析。P 　　3.4 甲胎蛋白含量测定： 各组AF