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主要内容 质粒的概念及特点 质粒构建的基本步骤和原理 一、质粒的概念 载体（vector;carrier;vehicle） 可以插入核酸片段、能携带外源核酸进入宿主细胞，并在其中进行独立和稳定的自我复制的核酸分子。基因工程中广泛应用的载体多来自人工改造的细菌质粒、噬菌体或病毒核酸等。多数载体是DNA分子，但某些RNA分子也能用做载体。 质粒（plasmid） 独立于染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌中染色体以外的双链、闭环DNA分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。分为紧密控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control) ①在宿主细胞中能保存下来并能大量复制，不影响受体细胞正常生命活动； ②有多个限制酶切点（MCS），而且每种酶的切点最好只有一个，可适于多种限制酶切割的DNA插入； ③含有复制起始位点，能够独立复制； ④有一定的标记基因，便于进行筛选。如pEGFP-n1质粒携带卡那霉素抗性基因，pcs2质粒携带氨苄青霉素抗性基因； ⑤载体DNA分子大小应合适，分子量小（1-10KD）、多拷贝、松驰控制型，便于操作及大量扩增，如我们实验室常用的 pcDNA3.1,pcs2-6myc, pEGFP-n1等。 三、质粒图谱阅读 五步阅读质粒图谱 第一步：首先看Ori的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）。 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。Ampr 氨苄抗性；kanr 卡那霉素抗性。neor 使G418失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。是否具有多个限制酶的单一切点。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA片段。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号。这是用来区别克隆载体与表达载体。 四、质粒构建的基本步骤和原理 背景介绍： 重组DNA技术（recombinant DNA technology）是基因功能研究的基本方法。应用该技术可以对DNA分子进行剪切和重新连接，构成重组DNA分子，然后把它导入宿主细胞，进而扩增相关DNA片段，表达相关基因的产物。克隆（clone）是指由一个细胞经过无性繁殖以后形成的子代群体。构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无性繁殖体系，即DNA的分子克隆（molecular cloning）过程。因此，重组DNA技术又称为基因克隆技术或基因工程技术。 基因克隆Gene cloning （以hBex2为例） Target gene: hBex2 Vector selection Primer design Amplification, digestion ligation Transformation Identification Gene cloning Target gene: hBex2 Vector selection Primer design Amplification, digestion ligation Transformation Identification Gene cloning Target gene: hBex2 Vector selection Primer design Amplification, digestion ligation Transformation Identification Primer design Primer design Before order it… Think about what should be included in linker: Kozak translation initiation site Initiation of translation in eukaryotes. Consensus sequence: GCC GCC A/GCC ATG G Open reading frames Open reading frames Gene cloning Target gene: hBex2 Vector selection Primer design Amplification, digestion ligation Transformation Identification Gene cloning Target gene: hBex2 Vector selection Primer design Amplification,