第三次实验-酶切回收连接.ppt

第三次试验：构建重组DNA 目的基因、载体的酶切消化 酶切产物琼脂糖凝胶电泳 DNA片段回收 目的基因、载体重组连接 基因工程常用工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 ＲＥ单位及实际用量： 在限定的温度和反应环境中，１小时消化1ugDNA所需的酶量为一个酶单位。由于种种原因，一般使用3-5u/ugDNA，延长３小时以上，是酶切反应更彻底。 RE保存条件：50%甘油中，用时需稀释10倍以上才能解除抑制。 酶切系统组成及计算方法：根据DNA量计算酶的用量，再计算酶切系统总体积、缓冲液和水的用量。 质粒DNA（1ug/ul ) 　 10 ug (10 ul) RE （20U/ul） 30-50 U (1.5-2.5 ul) 10?buffer 1.5-2.5 ul d3H2O 6 ul ——————————————————————— 总体积　　 15-25 ul 酶切操作步骤： 质粒DNA　　　1　 10 ul (10ug) 1 d3H2O 5 14 ul 2 10?buffer 4 3 ul 3 Xbal 2 1.5 ul (30 U) 4 Hind III 1.5ul (30 U) ———————————————————— 总体积　　　　3　 30 ul 加样，短暂离心，370C水浴消化。 二、DNA片段的琼脂糖凝胶电泳分离 原理：以琼脂糖凝胶为电泳支持物，DNA因分 子大小、形状、构象不同，在相同的电泳条件下，因迁移率不同而被分离。 DNA的琼脂糖凝胶电泳影响因素 1. 核酸分子大小：迁移率与分子量的对数成反 比，但当20kb时，迁移率不再依赖于分子大小； 2. 核酸构型:分子量相同的情况下，共价闭环DNA直线DNA开环环状DNA 3. 凝胶浓度:一定大小的DNA在不同凝胶浓度中迁移率不同； 4. 其它因素：缓冲液的成分、离子强度及电压（5v/cm）等 结果分析 三、DNA片段回收及纯化 DEAE－纤维素膜的电泳回收方法：紧靠目的DNA片段前方切一裂隙，将一条DEAE－纤维素膜插入裂隙中，继续电泳直至条带中所有的DNA均收集到膜上，然后从裂隙取出膜，用低离子强度的缓冲液洗掉污染物，最后在高离子强度的缓冲液中将DNA洗脱下来。 透析袋电洗脱法：将含有DNA片段的凝胶切下置于充满1xTAE的透析袋中，使凝胶块沉下，去掉大部分缓冲液，在凝胶上方夹紧透析袋，不留气泡，将透析袋浸泡在1xTAE电泳槽中，电泳2-3小时，使DNA从凝胶中电洗脱下来。 纯化： 1.DEAE－Sephacel柱层析法：将带负电荷的DNA结合到一种阳离子基质上而将污染物洗脱下来，再提高缓冲液的离子强度将DNA洗脱下来。 2.有机溶剂抽提法：用2-丁醇和酚－氯仿抽提。 制胶 点样 电泳分离 回收片段 抽提沉淀DNA 连接体系 目的基因： 8ul 载体质粒 2ul 10xBuffer 1.5ul T4 DNA连接酶 1ul 水 2.5ul 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 2. 平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端 目的基因 载体 限制性内切酶 限制性内切酶 T4 DNA连接酶 15oC 重组体 载体自连 目的基因 自连 3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 5′ 3′