百草枯致帕金森病机制的实验分析-experimental analysis of the mechanism of paraquat-induced parkinsons disease.docx

复旦大学博士研究生毕业论文中文摘要百草枯致帕金森病机制的实验研究+中文摘要帕金森病(Parkinsonsdisease，PD)为神经系统变性疾病，主要的病理改变是黑质纹状体通路的多巴胺能神经元变性，导致多巴胺减少和乙酰胆碱系统功能亢进。PD的发病机制至今尚不明确。自本世纪80年代发现l一甲基一4一苯基一l，2，3，6．四氢吡啶(MPTP)可导致PD样的表现后，环境因素在PD发病中的作用受到重视。众多研究发现除草剂的暴露可显著增加罹患PD的风险。除草剂一百草枯(paraquat，PQ)与多巴胺能神经毒物MPTP结构相似，具有与MPTP相似的神经毒性作用。最新研究表明百草枯可以导致小鼠PD样的行为表现和黑质纹状体通路的多巴胺减少以及黑质部位的多巴胺能神经元损害。以上研究提示百草枯可能是PD的重要致病因素。{研究表明多巴胺受体在PD的发病中起重要作用。百草枯既然能够造成小鼠纹状体区多巴胺减少，那么它是否会对多巴胺受体造成影响昵?本研究以口服给予小鼠百草枯的PD模型，采用免疫组织化学(ABc法)、原位杂交结合计算机图像处理分析技术，观察百草枯对纹状体区多巴胺Dl受体、多巴胺D2受体蛋白含量和基因表达的影响。结果发现，给予小鼠每日口服百草枯(10mg·k91)连续4个月后，纹状体区多巴胺Dl受体和多巴胺D2受体的蛋白含量和基因表达较对照组均明显减少(PO．01)，提示多巴胺Dl受体和D2受体可能参与了百草枯所致PD的发病机制；百草桔造成多巴胺D1受体和D2受体蛋白水平改变的重要原因之一是其影响了多巴胺Dl受体和D2受体的基因表达。多巴胺转运体(dopaminetransporter，DAT)和囊泡单胺转运体2(vesicularmonoaminetransporter2，VMAT2)在PD的发病中起重要作用。在百草枯所致PD的发病机制中是否有DAT和VMAT2参与，目前国内外均无报道。本研究采用免疫组织化学(ABE法)、原位杂交结合计算机图像处理分析技术，观察百草枯对小鼠黑质纹状体通路DAT和VMAT2蛋白含量和基因表达的影响。结果发现给予小鼠每日口服百草枯(10mg·kg。1)连续2个月后，黑质纹状体通路的DAT和VMAT2的蛋白含量和基因表达较对照组均明显减少(P0．01)。应用RT-PCR技术观察小鼠口服百草枯(每日10mg·kg。)不同时间后黑质部DAT和VMAT2基因表达的变化。结果发现从口服百草枯2周起，小鼠黑质部DAT和VMAT2的基因表达开始逐渐减少。以上结果提示DAT和VMAT2均可能参与了百草枯所致PD的发病机制。}本研究由上海市自然科学基金资助(004119∞5)复旦大学博士研究生毕业论文中文摘要有研究证实，DAT和VMAT2的比值能够反映神经元对多巴胺能神经毒物的敏感性。两者的比值高反映神经元对毒物敏感性的增加，两者的比值低则反映神经元对毒物敏感性的降低。本研究应用原位杂交技术观察DAT和VMAT2在不同脑区的mRNA表达水平并测定两者的比值，采用细胞计数来观察百草枯干预后多巴胺能神经元的损害。结果发现在黑质部DATmRNA和VMAT2mRNA的比值最高：在红核和下丘脑室旁核区域DATmRNA与VMAT2mRNA的比值和黑质部相比较低(P0．01)。百草枯干预后黑质部的多巴胺能神经元减少37．7％；红核和下丘脑室旁核区的多巴胺能神经元分别减少12．2％和13．I％，提示百草枯对黑质部多巴胺能神经元的损害具有相对选择性，其原因可能与黑质部DATmRNA和VMAT2mR．NA的比值高有关。多巴胺Dl受体信号转导主要由环磷酸腺苷(cyclicadenosinemonophosphate，cAMP)依赖性蛋白激酶(proteinkinase，PKA)系统参与。多巴胺和环磷酸腺菅调节的磷酸化蛋白(dopamine—andcyclicAMP．regulatedphosphoprotein，DARPP一32)被认为是多巴胺D1受体特定的标志物，受脑内多巴胺和cAMP调节，是PKA重要作用底物之一。DARPP一32对多巴胺D1受体的作用起放大功能，是体内调节多巴胺Dj受体功能的重要因子。本研究应用液闪测定技术观察百草枯对小鼠纹状体区DARPP．32磷酸化程度的影响。结果发现给予小鼠口服百草枯(10mg·kg’1)4个月后，纹状体区DARPP一32的磷酸化程度减低，提示百草枯可能通过cAMP／PKA系统减弱体内DARPP一32的磷酸化程度，调节其对多巴胺D。受体信号转导途径的作用。)结论：1．百草枯所致PD的发病机制可能包括多个环节，其中突触前DAT和VMAT2、突触后多巴胺Dl受体和D2受体都可能参与其中。2．在百草枯所致PD的机制中还可能包括DARPP。32的磷酸化对多巴胺D1受体信号转导的调节作用。由于百草枯干预后可导致小鼠