百草枯致肺损伤过程中内质网应激对hif-1α的影响-effects of endoplasmic reticulum stress on hif - 1α during paraquat-induced lung injury.docx

百草枯致肺损伤过程中内质网应激对HIF-1α的影响摘要百草枯(paraquat,PQ)是全球广泛使用的除草剂，人畜中毒后死亡率极高。肺是其作用的主要靶器官，百草枯中毒后迅速蓄积于肺内，肺内百草枯浓度是血浆中的6到10倍，百草枯可以迅速破坏肺的实质细胞，引起肺出血、水肿，最终引起肺纤维化，患者最终死于肺纤维化。到目前为止，百草枯中毒没有特殊解毒药物，治疗措施有限，患者病死率高达60%~80%。因此深入探讨百草枯中毒导致肺纤维化的发生机制具有重要的意义。缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducedfactor-1α,HIF-1α）通过多种途径调节人体许多组织(肝脏、肾脏、心脏)的纤维化过程，在百草枯中毒，缺氧诱导因子1α的高表达与肺纤维化关系密切，因此研究缺氧诱导因子1α的发生机制具有重要的意义。既往研究显示，低氧是上调缺氧诱导因子1α的主要因素，然而我们前期工作发现百草枯中毒2h后大鼠肺组织中缺氧诱导因子1α表达明显增高，而低氧则发生在中毒后6h。因此，我们推测在百草枯中毒中，缺氧诱导因子1α的上调并不是通过缺氧诱导的，那么缺氧诱导因子1α的高表达是如何实现的。研究证实在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起的肺损伤中，抑制内质网应激（endoplasmicreticulumstress,ERS）可以明显的抑制缺氧诱导因子1α的表达，而低浓度的百草枯刺激可以引起肺泡上皮细胞发生内质网应激，表现为分子伴侣糖调节蛋白78（glucose-regulatedprotein78，GRP78）、糖调节蛋白94（glucose-regulatedprotein94，GRP94）增加。为了探讨内质网应激是否通过上调缺氧诱导因子1α的表达参与肺纤维化及其可能的分子机制，本课题进行了以下研究。目的：缺氧诱导因子1α在百草枯致肺纤维化中发挥重要的作用，但是其上游调控1因子尚不清楚，因此本研究分别从体内体外研究探讨在百草枯中毒中，内质网应激上调缺氧诱导因子1α表达的可能机制。方法：1.百草枯中毒动物模型建立将60只健康雄性SD大鼠随机分为对照组（10只）、染毒组（50只）。对照组采用生理盐水（1ml）一次性灌胃；染毒组按照50mg/kg的20%的百草枯溶液一次性灌胃（生理盐水稀释至1ml）。灌胃后按照24h,48h,72h,96h,168h分组，每组10只大鼠，采集肺组织标本。2.体内实验：（1）制备百草枯中毒大鼠模型，收集不同时间点的肺组织标本；苏木素-伊红(hymatoxylinandeosin，HE)和Masson染色评估肺组织病理学改变；免疫组化和WesternBlot检测肺组织中糖调节蛋白78（glucose-regulatedprotein78，GRP78）、X-盒结合蛋白1（Xbox-bindingprotein1，XBP-1）和缺氧诱导因子-1α的表达水平。（2）制备百草枯中毒大鼠模型，采用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸预处理动物；免疫组化和WesternBlot检测肺组织中内质网应激标志物、缺氧诱导因子-1α的表达。3.体外实验：（1）制备百草枯中毒体外模型，采用不同浓度的百草枯处理人肺癌细胞A549、大鼠肺泡上皮细胞RLE-6TN细胞不同时间，筛选出百草枯处理的浓度及时间；采用WesternBlot检测细胞内糖调节蛋白78、X-盒结合蛋白1和缺氧诱导因子-1α的表达。（2）制备百草枯中毒体外模型，采用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸给予预处理，采用WesternBlot检测人肺癌细胞A549、大鼠肺泡上皮细胞RLE-6TN细胞内糖调节蛋白78、X-盒结合蛋白1和缺氧诱导因子-1α的表达。（3）制备百草枯中毒体外模型，采用GRP78-siRNA技术处理人肺癌细胞A549细胞，采用反转录聚合酶链反应（reversetranscription-PCR，RT-PCR）技术检测细胞中糖调节蛋白78、X-盒结合蛋白1和缺氧诱导因子-1α的表达，WesternBlot2检测NF-κB家族成员p65蛋白的表达。结果：1.HE结果显示百草枯中毒后大鼠肺组织出现急性弥漫性损害，表现为炎性细胞浸润，增厚。随着中毒时间延长，炎性细胞大量增加，肺泡壁断裂，严重时出现弥漫性肺出血，甚至结构消失。2.Masson染色结果表明正常对照组肺泡结构正常；百草枯染毒组可以看见蓝染的胶原纤维，胞质和红细胞呈红色，细胞核被染成蓝褐色，并且随着染毒时间延长，蓝染的胶原纤维增多。3.WesternBlot和免疫组化结果显示百草枯中毒后，大鼠肺组织和人肺癌细胞A549、大鼠肺泡上皮细胞RLE-6TN细胞内糖调节蛋白78、X-盒结合蛋白1和缺氧诱导因子-1α的表达明显增高。4.采用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸可以明显抑制缺氧诱导因子-1α的表达，这一结果提示内质