百脉根小gtpase pop6与网格重链蛋白chc相互作用的研究-study on the interaction between small gt pase pop6 from lotus root and the grid heavy chain protein chc.docx

百脉根小GTPase ROP6与嘲格重链蛋白CHC丰|I百作J玎的研究摘要根瘤菌所产生的结瘤因子是豆科植物与根瘤菌建立共生固氮体系的信号分子， 豆科植物LysM．RLK是识别根瘤菌结瘤因子的受体激酶。在模式豆科植物百脉根中 结瘤因子受体激酶被命名为NFRl和NFR5，它们可能形成异源二聚体共同识别和接 受结瘤因子而开启宿主内共生信号转导途径。为了深入理解豆科植物与根瘤菌共生 体形成的机制，本研究在分离到与结瘤因子受体激酶NFR5相互作用的小G蛋白 ROP6的基础上，通过酵母双杂交技术，从百脉根AD—eDNA文库中筛选并鉴定出与 ROP6相互作用的阳性克隆。主要研究结果如下：1．对得到的酵母阳性克隆子，经分离靶质粒、PCR扩增、酶切鉴定证实含有外 源片段及其大小，并通过回转酵母进一步验证与诱饵质粒上ROP6间的相互作用。 然后，经DNA序列测定和NCBI数据库BLAST分析结果表明，其目的DNA编码 网格重链蛋白CHC的两个模体，命名为CHCR。2．在酵母体内研究了网格重链蛋白CHCR与ROP6、CA突变体(I的P6组成型 活化突变体)和DN突变体(ROP6功能缺失突变体)间的相互作用。实验结果表明， ROP6的两种突变体都能与网格重链蛋白CHCR互相作用。3．分别在大肠杆菌中表达并纯化CBD—CHCR和His．ROP6融合蛋白，利用 Pull．down技术证实了CHCR和ROP6的体外相互作用。同时，双分子荧光互补(BiFC) 研究结果说明了CHCR和ROP6在烟草叶片表皮细胞中的相互作用。4．利用酵母双杂交技术，研究了与ROP6相互作用的CHCR模体，含单个CHCR 模体的蛋白不能与ROP6相互作用；同时含有2个CHCR模体的蛋白才能与ROP6 相互作用。5．以CHCR为诱饵蛋白筛选百脉根eDNA文库，获得了网格轻链蛋白和C3HC4 类型的E3连接酶的RING结构域。关键词：百脉根；小G蛋白ROP6；网格重链蛋白；酵母双杂交；双分子荧光互补华·11农qk人学201 l届硕士学位论文Abs仃actNodulation(Nod)factor signaling molecules are essential for rhizobia to initiate the symbiotic nitrogen—fixing interaction with legumes in the early stages of process．The LysM··RLK is required for the recognition of Nod factor in the symbiotic nitrogen—·fixing interaction，the receptor kinases of Nod factor are called NFRl and NFR5 in model plant Lotus japonicus，they may form heterodimer to recognize and receive the common nodulation factor to start the symbiosis signal transduction pathway．For furtherunderstanding the mechanism of the symbiosis process between the Rhizobium and theLegume，we screened the AD-eDNA library of Lotusjaponicus by yeast two—hybrid using the small GTPase ROP6 as the bait，and identified the small GTPase interacted proteins．This work was base on the fact that this small GTPase is identified by yeast two-hybridsystem using NFRS(NFR5一PK)as the bait．We get the following main results：1．The prey plasmids Was isolated from the positive clones，PCR amplification and restriction endonuelease were used to identify the insertion fragment of the prey plasmids． By sequence BLAST in NCBI databanks，the insertio