胞囊线虫heterodera globodera的分子标记-molecular markers of hetero dera globo dera.docx

呈塑曼型垡!塑主堡茎堕塞丝皇!璺堂竺塑竺垒!塑唑竺!箜坌三堡里摘要本研究用RAPD技术为大豆胞囊线虫作分子标记并将不稳定的RAPD标记转化为稳定的SCAR标记。用可扩增出大豆胞囊线虫多态性片断的12个随机引物OPA02、OPA03、OPA06、OPA09、O队13、OPAl8、OPBl5、OPC06、OPDl3、OPG06、OPG08、OPKl6寻找大豆胞囊线虫与几种胞囊形线虫间存在的差异，将大豆胞囊线虫的特异性片断进行回收、克隆、测序，在原来随机引物OPA06的10个碱基基础上，增加14个碱基，设计了一对24个碱基的大豆胞囊线虫的SCAR引物SCNFI和SCNRI，同时还设计了马铃薯金线虫的一对特异性引物GrFI和GrRI，通过覆盖全国大豆主产区的38个大豆胞囊线虫群体以及10个禾谷胞囊线虫群体、2个马铃薯金线虫和2个马铃薯白线虫群体对所设计的SCAR引物进行检测，检测率达100％。这说明这个SCAR标记在不同胞囊线虫材料中稳定性商、特异性好，克服了通常的RAPD标记不稳定、不易重复等缺点。用单个胞囊或单头二龄幼虫的DNA作为模板，同样很好的扩增出SCAR标记的特异性片断，为了提高该试验的灵敏性，将上述模板稀释10倍，扩增结果也非常好。试验结果说明，此标记稳定、可靠、操作简单且灵敏度高。可对大豆胞囊线虫单个胞囊、单头二龄幼虫进行鉴定，在利用现有的大豆胞囊线虫特异性引物的基础上，建立快速准确检测和早期诊断大豆胞囊线虫的分子生物学方法和技术规程。用RFLP-PCR技术研究了中国河南省4个地区9个禾谷胞囊线虫群体核糖体DNA(rDNA)内转录问隔区(ITS)的遗传变异．用PCR技术扩增禾谷胞囊线虫群体的ITS长度为1060bp。用8种限制性内切酶(RE)酶切禾谷胞囊线虫ITS扩增产物，共产生18个酶切片断。ITS-RFLP的研究能直观地观测到禾谷胞囊线虫种内1TS分子多态性，彭德良等对中国和摩洛哥禾谷胞囊线虫的rDNA·ITS进行扩增，得到1060bp的片斯，同时使用了Hinfl、AluI、AvaI、HindllI、Co]I、RsaI、月砸III等几种限制性内切酶，酶切结果与本研究得到的结果一致。AvaI和HindllI2种酶不能酶切禾谷胞囊线虫ITS产物。此结果说明与先前研究的中国禾谷胞囊线虫群体不存在差异。关键词：胞囊线虫；RAPD；SCAR；RFLP重茎壅些查兰塑主堕塞些塞垡皇!丝竺堂苎曼丝!塑!塑坌±堑堡AbstractThestudydescribesthedevelopmentofspecies-speciepairsofPCRprimersforthecystformingnematodesHeteroderaglycinesandGloboderamstochie}拈isthatamplifyspecies-specificRAPDfragments．RandomprimersOPA02、OPA03、OPA06、OPA09、OPAl3，OPAl8，OPBl5，OPC06，OPDl3，OPG06，OPG08，OPKl6。acquiringthespecies—specificfragmentthatOPA06amplified．Aftersequencingthefiagrnents，longerprimersweredesignedtocomplememtheterminalsequencesofthepolymorphicDNAfragments．Theresultingpairsofprimerswereusedtogeneratethesequence-charaterizedamplifiedregions(SCARs)．UsingthedevelopedpairsofSCARprimers．SCARfragmentsofH．．glycinesandGrostochiensiswereeasilyamplifiedfromDNAextmctesfromsinglecystorjuvenilesoftheparticularnematodespeciesinvestigated．TheSCAR—PCR．b酗edassaysdesribedhavepotentialtobeoptimizedforroutinepracticaldiagnostictests．111eusefulnessofconvertingRAPDmarkersintoSCARmarkersisdiscussed．111eamplificationoftherDNA-ITSregionofeachpopulationof且删胧(CCN)fromZhengzhou，Henanprovince，Chinarespectively,yielded