胞内抗体抑制bcrabl蛋白酪氨酸激酶活性诱导慢性髓系白血病细胞凋亡的实验分析-experimental analysis of intracellular antibody inhibiting bcr abl protein tyrosine kinase activity inducing apoptosis in chronic myeloid leukemia cells.docx

中国协和医科大学中国医学科学院博士研究生学位论文常见英文缩略语(按字母顺序排列)Amp氨苄青霉素bp碱基对BSA牛血清白蛋白CML慢性髓系白血病DAB二氨基联笨胺DEPC焦碳酸二乙酯DEVD含4氨基酸的caspase．3酶切底物DMSO二甲基亚砜DOC脱氧胆酸钠DTT二硫苏糖醇EB溴化乙锭E．coli大肠杆菌EDTA乙二胺四乙酸eGFP增强型绿色荧光蛋白FACS荧光激活流式细胞分选术FCS胎牛血清FITC异硫氰酸荧光素GAPDH葡萄糖．6．磷酸脱氢酶H小时HBSHEPES一缓冲盐溶液HEPESN-2-羟乙基哌嗪．Ⅳ。2．乙磺酸HRP辣根过氧化物酶ICL链间连接区intrabody胞内抗体IRES内核糖体进入位点mAb单克隆抗体Min分钟中国协和医科大学中国医学科学院博士研究生学位论文MSCV鼠科干细胞病毒nm纳米0D吸光度PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳PARP聚ADP．核糖聚合酶PBS磷酸缓冲盐溶液PCR聚合酶链式反应PEG聚乙二醇PI碘化丙啶pNAcaspase一3活性检测试剂盒显色反应底物PMSF苯甲基磺酰氟PS磷脂酰丝氨酸PTK蛋白酪氨酸激酶RI放射强度RIPA放射免疫沉淀分析RNaseARNA酶Arpm每分钟转速RT逆转录SDS十二烷基硫酸钠See秒钟SD标准差sFv单链抗体TBSTris缓冲盐溶液TBS—T含O．05％吐温20的Tris缓冲盐溶液TEMED四甲基乙二胺Tris三羟甲基氨基甲烷VH免疫球蛋白重链可变区VK免疫球蛋白1c轻链可变区一2一中国协和医科大学中国医学科学院博士研究生学位论文胞内抗体抑制BCR／ABL蛋白酪氨酸激酶活性诱导慢性髓系白血病细胞凋亡的实验研究(摘要)慢性髓系白血病(CML)特征性的BCR／ABL融合基因产物口2108687ABo异常增高的蛋白酪氨酸激酶(PTK)活性在CML病理发生中起关键作用。我们实验室应用基因重组技术构建了逆转录病毒载体MSCV．ib．IRES—eGFP，在真核细胞内表达针对ABL蛋白酪氨酸激酶活性域的基因工程单链抗体(sFv)，又称为胞内抗体(intrabody)。为探讨应用胞内抗体技术抑制BCR／ABLPTK活性，阻断BCR／ABL信号转导途径，深入研究ABL蛋白酪氨酸激酶活性改变影响CML细胞凋亡特性的机制，并为最终用于临床治疗CML提供实验依据，本论文进行了以下几个方面的工作：1．将逆转录病毒载体MSCV—ib．IRES．eGFP在原核系统扩增后转染包装细胞，制备出具有感染能力的病毒。用病毒上清转导BCR／ABL基因阳性的K562慢性髓系白血病细胞系，建立了表达抗ABL蛋白酪氨酸激酶胞内抗体的体外细胞模型。2．研究胞内抗体在K562细胞内表达后，细胞总蛋白、p2108。87“8。蛋白、c-ABL(p145AB。)蛋白酪氨酸激酶活性的变化，细胞凋亡特性的改变以及对细胞增殖、细胞内周期蛋白cyclinD2表达量、细胞周期时相分布的影响。3．将表达胞内抗体的K562细胞接种裸鼠体内，通过动物实验研究胞内抗体对K562细胞体内致瘤性的的影响。结果，获得纯化的表达抗ABL蛋白酪氨酸激酶区胞内抗体(简称ib)和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)的细胞模型：K562．ib．eGFP。该细胞cap2108。87ABL和p145A8。蛋白表达水平无明显降低，但p210Bc“7“BL和p145“8。酪氨酸激酶活性较未转导的K562细胞下降达76％(PO．05)，细胞总蛋白酪氨酸激酶活性也下降48％(P0．05)，提示胞内抗体在细胞内获得了正确折叠，并对靶蛋白PTK活性起到明一3一中国协和医科大学中国医学科学院博士研究生学位论文显赫涮作嗣。与室载体转海酶K562一eGFP绥藏帮未转学静K562缩胞相比，K562．ib．eGFP细胞在细胞毒性药物etoposide处理后或无血清臻养条静下，至臻饔显戆褥亡趋势。与j羹：同辩重，缀稳内重螯凋亡效应分子caspase．3的活化程度也有显著差异，经1099／mLetoposide处嚣24至48小露，K562．ib．eGFP细箍内caspase．3活往显著离子对照细胞。细胞生长曲线显示，K562-ib—eGFP细胞体外增殖速度减慢。筵豁，缀蕤癌eyclinD2表达窳警爨显{粜于对照缨疆。淀式缀耱搜捡测发现对数生长的K562一ib．eGFP细胞中Go．Gl期的细胞数量明显增多，S囊纲戆魄铡减少。将K562-ib—eGFP细胞与对照组分别接种裸鼠皮下形成实体瘤，实验缝瘗块体积鞠鼹枣予辩照錾，在缯稳移禳黪第14，2l秘28天，实验组肿瘤体积均小于对照组的1／2(P0．05)，转导胞内抗体的细胞在实验动物搭蠹生长鳃显缓漫。我们的结论是，在K562细胞内表达抗ABL蛋白酪氨酸激酶胞内挽传能特羚蛙地麴裁ABL蛋自酪氨酸激酶遗性，奁髂羚雩|起缨照对凋亡刺激的敏感性