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蛋白质层析技术 蛋白质层析介质 蛋白质层析技术  蛋白分离纯化平台 及单抗的分离纯化 层析的概念 层析一般地是一种物理方法 层析的热力学分析：分配; 吸附等温线；吸附脱附（解吸附，洗脱）；线性和非线性过程 层析的动力学分析：塔板理论（板高方程） 层析是最强有力的分离手段 液相层析 蛋白液相层析的应用 蛋白液相层析的构成 蛋白液相层析的一般程序 样品制备 分离纯化机制 蛋白质层析介质基体须具备的特性 生物兼容性：亲水性，大孔径.不会使生物大分子失活，没 有生物化学毒性：过强吸附，泄漏，氧化还原性 化学稳定性：在生物大分子存在的化学条件下是稳定的. pH,络合物,巯基化合物… 必要的机械性能: 流体中的耐压性 结构:典型层析介质的放大观察 下图:2%agarose gel 白 线段: 500nm 右图:Sephacryl S-500 右上:白线段 10um 右下:白线段0.5um 化学组成:亲水多孔高聚物等 天然高分子多糖:纤维素,交联葡聚糖,琼脂糖及共聚物孔径分布宽,较软 合成高聚物:聚丙烯酰氨类,聚丙烯酸脂类,聚乙二醇聚丙烯酸脂共聚物,亲水性处理的聚苯烯类 无机化合物: 硅胶, 羟基磷灰石, 氧化锆 聚合物基体(matrix)孔的结构 孔径分布:分配层析要求分布宽,均匀,相应于低交联度 高交联度导致孔径分布偏向高,介质本身微观不均匀性变大,适合大孔径高硬度吸附层析 孔的结构可分为三种类型 标志产品: SepharoseHP，Toyopearl；MacroPrep，UNOSphere，SOURCE；UNOQ，POROS 基体孔结构决定传质特点 孔结构决定扩散速率：孔的开放性越大，扩散越快，对层析的流速越不敏感；反之亦反 动态载量（Dynamic Capacity） 动态载量是制备层析的重要概念：层析过程是偏离平衡态的，流速越大，偏离越远，反之亦反 动态载量是制备层析介质的重要性能指标，更快更高是人类活动的重要目标 层析介质颗粒度与动态载量 小颗粒传质更迅速，动态载量更高 IgG1在不同颗粒度的Bio-Rad陶瓷性羟基磷灰石上的动态载量比较 Buffer-0.05M MES,pH6.5; Flow rate: 600cm/hr 吸附动力学与动态载量 长程作用（库仑力）比短程作用（疏水相互作用）受流速影响小些；粘度与动态栽量负相关 从动态载量看上样条件 BSA在阴离子交换介质上的动态载量： 吸附量对洗脱剂的非线性：动态载量对洗脱剂强度远比对其洗脱体积敏感 吸附蛋白的大小与动态载量 层析介质表面吸附功能基团的密度大大超过实际用来吸附蛋白的量 小分子对层析介质表面吸附功能基团的密度更加敏感 塔板高度 分辩率 不同吸附机制的洗脱峰宽与流速 BSA在同样尺寸层析柱,同样基质颗粒度,同样上样量 结论:影响峰宽的因素还有溶液粘度,洗脱动力学;在其它相同的情况下,离子交换层析比疏水层析的分辩率要高一些 分离机制选用策略 分步洗脱还是梯度洗脱？ 几步完成纯化？ IgG样品中蛋白酶的降解作用 目标产物IgG中残存蛋白酶的降解作用对pH有很强的依赖性 蛋白酶作用量:用每克IgG中被消化的IgG的毫克数来表示 阳离子交换与DNA污染 某阳离子交换层析用于早期步骤分离一株小鼠IgM 阴影为测得的IgM 折线表示的DNA含量范围10exp610exp10 同样的起始样品不同的纯化方案 R:含目标IgM的起始粗提物 方案A:两步离子交换最后一步低离子强度下分子排阻 方案B:疏水层析,阴离子交换,最后高离子强度下分子排阻 层析仪是实现蛋白分析纯化的场所 蛋白质液相层析有其特殊性-生物相容性和化学稳定性 对层析仪有与小分子物质液相层析不同的要求 液相层析仪已是非常成熟的设备 液相层析仪的基本结构 输液泵——注射泵 输液泵——恒压泵 输液泵——双柱塞泵 不同泵的输液特性 液相层析仪的特性 层析仪的核心是输液泵 更换泵头技术 任何泵的流量范围都很有限 更换泵头技术是扩大流量范围的最优性价比的方案 该技术在Bio-Rad DuoFlow蛋白层析仪上实现 泵的消耗费用很低，只需更换密封垫圈 泵决定了层析仪的特性 单柱塞单泵低压混合——Waters 650系列 双柱塞单泵低压混合——BioCAD 单柱塞双泵高压混合——Gilson，Beckman 双柱塞双泵高压混合——HP, Bio-Rad, APB AKTA 检测器 蛋白质液相层析对检测器的要求较简单，多波长检测使用机会较少，而电导检测必不可少（2M (NH4) 2SO4 ~230ms/cm） 其它如pH检测器、折光检测器、荧光检测器、液质联用 检测器的消耗费用是层析仪中最昂