白花蛇舌草总黄酮对实验性溃疡性结肠炎作用及免疫学机制研究.docVIP

白花蛇舌草总黄酮对实验性溃疡性结肠炎作用及免疫学机制研究 　　[摘要] 目的：观察不同剂量白花蛇舌草总黄酮（FOD）对溃疡性结肠炎（UC）模型小鼠结肠NF-κB及IL-8，TNF-α，IL-10表达的影响，探讨其抗UC的免疫学机制。方法：60只雄性昆明小鼠随机分成6组：对照组（Cont）蒸馏水灌胃，其余5组均自由饮用4%右旋葡聚糖硫酸钠（DSS）水溶液7 d以造成急性UC，同时给予下列药物灌胃：蒸馏水（DSS组），柳氮磺胺吡啶（SASP）500 mg·kg-1·d-1（DSS+SASP组），FOD 60 mg·kg-1·d-1（DSS+FOD-H组），FOD 40 mg·kg-1·d-1（DSS+FOD-M组），FOD 26.7 mg·kg-1·d-1（DSS+FOD-L组）。造模给药期间，每天对各组小鼠进行疾病活动指数（DAI）评分。造模7 d后处死小鼠，取结肠组织标本，对结肠黏膜进行病理组织学损伤评估；用免疫组化法检测NF-κB p65的表达，ELISA法检测结肠组织中IL-8，TNF-α及IL-10的表达。结果：自由饮用4%DSS水溶液7 d可成功造成小鼠急性UC，与对照组比较，DSS组小鼠的DAI、结肠病理组织学损伤评分明显上升，结肠组织中NF-κB p65及IL-8，TNF-α表达显著增多，IL-10表达明显降低（P-1·d-1预防给药7 d，可完全或部分对抗DSS引起的上述改变。与DSS组比较，DSS+FOD-H组、DSS+FOD-M组的DAI、结肠病理组织学损伤评分降低，IL-8，TNF-α及NF-κB p65表达下调，IL-10 表达上调（P　　[关键词] 白花蛇舌草总黄酮；溃疡性结肠炎；NF-κB p65；IL-8；TNF-α；IL-10 　　[收稿日期] 2013-08-04 　　[基金项目] 广东省中医药局项目；湛江市科技攻关项目（2010C3106004） 　　[通信作者] *钟志国，副主任中医师，TelE-mail：luosy76@126.com 　　[作者简介] 罗世英，硕士，副教授，TelE-mail：luosy76@126.com 　　溃疡性结肠炎（ulcerativecolitis，UC）是一种多因素、多层次的病因未明的难治性非特异性炎症性肠病，近几年在我国的发病率逐渐上升。大多数研究认为UC与免疫反应异常、氧化损伤、感染等有关。免疫异常机制认为促炎细胞因子与抗炎细胞因子二者发生失衡，促炎细胞因子的致炎作用超过了抗炎细胞因子的抑炎作用，从而促使炎症的发生[1]。随着研究的深入，发现UC的发病和NF-κB有着密切的关系。NF-κB在UC中呈现过度激活状态，并导致炎性细胞因子的过度和持续表达，放大了炎症反应[2-3]。 　　白花蛇舌草总黄酮（total flavones of Oldenlendia difflusa，FOD）是从白花蛇舌草中提取的有效部位，文献报道FOD具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎及抗菌、抗氧化等作用[3-4]。本课题组前期研究发现FOD通过减少自由基生成、抑制脂质过氧化反应和增强抗氧化能力对右旋葡聚糖硫酸钠（dextran sulphate sodium， DSS）诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠有保护作用[5-6]。本实验在前期研究的基础上，成功建立DSS诱导的小鼠UC急性期模型，进一步明确FOD对UC急性期的疗效，通过观察其对UC小鼠结肠黏膜中NF-κB p65及促炎因子IL-8，TNF-α和抗炎因子IL-10表达的影响来探讨其抗UC可能的免疫学机制。 　　1 材料 　　1.1 药品与试剂 白花蛇舌草药材购于广东医学院附属医院中药房，药材经广东医学院药学院生药教研室阎冲博士鉴定为白花蛇舌草正品。FOD，褐色干浸膏，由阎冲博士提取，具体提取方法如下：取白花蛇舌草200 g，70%乙醇超声提取2次，每次40 min。合并滤液，减压浓缩至无醇味，静置后离心取上清液，上聚酰胺柱子（30～60目），纯净水洗脱至流出液无色，70%乙醇洗脱至流出液盐酸-镁粉呈阴性，减压浓缩至100 mL，将100 mL溶液用蒸发皿蒸干，得FOD褐色干浸膏。以芦丁为对照品，经HPLC鉴定和含量测定，总黄酮质量分数达61%，临用时用蒸馏水溶解成相应的浓度备用。柳氮磺胺吡啶（SASP）由上海三维制药有限公司生产，批号20110C2，临用时研磨粉碎，蒸馏水溶解，配成50 g·L-1的溶液备用；DSS，美国MPBIO公司产品，货号0216011090，相对分子质量36 000～50 000，应用时配成4%浓度；NF-κB p65免疫组化试剂盒由上海科彩生物科技有限公司提供，批TNF-α，IL-8，IL-10 ELISA试剂盒等均