海带多糖对光老化皮肤基质金属蛋白酶活性影响实验研究.docVIP

海带多糖对光老化皮肤基质金属蛋白酶活性影响实验研究 　　[摘要] 目的：探索海带多糖（laminaria polysaccharide，LP）对光老化皮肤基质金属蛋白酶活性的影响。 　　方法：SPF级昆明小鼠背部剃毛，随机分为对照组、模型组、海带多糖低剂量组（LP-L，1 mg·kg-1）、海带多糖高剂量组（LP-H，5 mg·kg-1）、Vit E组（100 mg·kg-1），每日腹腔注射给药2次。除对照组外，每日紫外线照射1 h，每周照射5次，UVB累积照射剂量为21.60 J·cm-2，UVA累积照射剂量为84.02 J·cm-2。8周后，取背部暴露皮肤，行HE染色测量真皮层厚度，化学比色法检测皮肤羟脯氨酸（Hyp）含量，ELISA法检测血清基质金属蛋白酶-1（MMP-1）、金属蛋白酶组织抑制物（TIMP-1）的含量，Real-time PCR法分析皮肤MMP-1，TIMP-1 mRNA的相对含量。 　　结果：与模型组比较，LP-H组可以显著增加真皮层厚度、皮肤Hyp含量及血清TIMP-1的水平，显著降低血清MMP-1水平及皮肤MMP-1 mRNA相对含量。 　　结论：海带多糖可以通过调节基质金属蛋白酶活性来调节光老化皮肤胶原蛋白的代谢。 　　[关键词] 海带多糖；光老化；胶原蛋白；基质金属蛋白酶；羟脯氨酸 　　海带中医入药时叫昆布，海带中含有多种生物活性成分，具有多种药理作用，而它的大部分生物活性与其中的多糖成分密切相关。相关研究表明，海带多糖（laminaria polysaccharide，LP）具有抗氧化、抗辐射、抗凝血、保护血管内皮细胞等多种生物功能[1-2]。皮肤长期受到日光照射（主要是紫外线中的UVA和UVB波段）引起的损害，称为皮肤光老化。紫外线辐射可使真皮成纤维细胞功能受损，合成和分泌前胶原蛋白的能力下降，还可以使基质金属蛋白酶高表达，特异性的降解细胞外基质成分，破坏胶原蛋白（纤维）的正常结构[3]。本研究探讨海带多糖是否能够通过调节基质金属蛋白酶的活性来调节光老化皮肤胶原蛋白的代谢。 　　1 材料 　　1.1 动物 雌性昆明小鼠，SPF级，6周龄，由广西医科大学医学实验动物中心提供，合格证号SCXK（桂）2009-0003。 　　1.2 药品与试剂 海带多糖由本实验室自行提取，其糖含量为71%，硫酸根含量为83.28 mg·g-1；羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；基质金属蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1， MMP-1）、金属蛋白酶组织抑制物-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1） ELISA试剂盒（武汉华美公司）；总RNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]；cDNA合成试剂盒（美国MBI）；SYBR GREEN PCR Master Mix（TaKaRa公司）。 　　1.3 仪器 UVA和UVB紫外灯管（北京电光源研究所）；UVA和UVB剂量用紫外线强度测定仪（台湾路昌公司）；紫外-可见光分光光度计（上海精科）；iMARK型全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）；光学显微镜（日本Olympus公司）；Centrifuge 5417R离心机（德国Eppendorf公司）；ABI7300荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司）。 　　2 方法 　　2.1 光老化动物模型的建立 参考相关文献方法[4]，小鼠背部剃毛，面积2 cm×2 cm，置于荧光紫外灯下（UVA+UVB，模拟日光）照射，照射距离50 cm。每天照射1 h，每周照5次，连续照射8周，UVB（280～320 nm）累积照射剂量为21.60 J·cm-2，UVA（320～400 nm）累积照射剂量为84.02 J·cm-2。 　　2.2 动物分组及取材 小鼠随机分为5组，每组12只。即对照组（注射等体积生理盐水）、模型组（注射等体积生理盐水）、海带多糖高剂量组（LP-H，5 mg·kg-1）、海带多糖低剂量组（LP-L，1 mg·kg-1）、维生素E组（Vit E 100 mg·kg-1）。以上各组给药腹腔注射，每日2次。造模结束后，小鼠眼球取血（用于血清相关指标的检测），并迅速取出光照部位皮肤，用预冷生理盐水冲洗干净，取部分皮肤置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，石蜡包埋后用于形态学观察。剩余标本用滤纸吸干后，立即置液氮中速冻，然后放-80 ℃冰箱中冻存，用于皮肤羟脯氨酸含量检测及Real-time PCR检测。 　　2.3 皮肤组织学观察 将上述石蜡包埋标本切片，行苏木精-伊红（HE）染色，光学显微镜下观察皮肤真皮层情况，并拍照记录。用Min.3图像处理与分析系统测定皮肤真皮层的厚度，每张切