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利用计算机软件Design Experter优化菊粉酶合成研究 　　菊粉酶是一种将菊糖分解为低聚果糖的水解酶，而低聚果糖是一种功效显著的保健饮品。为了提高黑曲霉产菊粉酶的活力，本为采用计算机软件Design Experter，对以粗菊芋粉、麸皮和硫酸铵组成的培养基进行了优化，结果使菊粉酶活力从134.30 U/mL提升到185.18 U/m，提高了38%，取得了较为理想的效果。为计算机统计软件有效应用到生物技术工艺中提供了参考。 　　【关键词】VLAN 静态路由 访问控制 　　1 前言 　　菊粉酶是一类能够水解菊粉分子链中β-2，1-D-果糖糖苷键的水解酶 （EC3.2.1）。菊粉酶主要来源于菊科植物的组织和部分微生物。来源于微生物-主要为黑曲霉的菊粉酶一般分为内切酶和外切酶，内切酶主要从菊糖分子内部随意水解β-2，1-D-果糖糖苷键，而外切酶主要从菊糖分子末端逐个水解果糖分子。 　　产菊粉酶的菌种一般是从腐烂的菊芋或菊苣的根际土壤中分离，并利用以菊粉为唯一碳源的分离培养基分离筛选得到的。Guillermo等用RB（remazol brilliant）亮蓝染料法，筛选得到两株高产菊粉酶的菌株VIR9和VIR64。Shama 和 Ge等人从菊苣根部的土壤中分离出青霉菌，再经NTG-UV和EtBr-UV处理后，其菊粉酶活力有所提高，表明产菊粉酶的微生物在经过诱导有机突变的物质处理后，菊粉酶活有所提高。但当前微生物产菊粉酶的活力仍不足工业化推广，而且使用菊糖为碳源，必将提高产菊粉酶的成本，本文以筛选得到的黑曲霉，采用麸皮和粗菊芋粉为碳源，以硫酸铵为氮源，采用计算机软件Design Experter对培养基的组成了优化，取得了较为理想的效果。 　　2 材料与方法 　　2.1 材料 　　2.1.1 黑曲霉摇瓶产酶培养基（g/L） 　　粗菊芋粉 20 g/L，麸皮 20 g/L，硫酸铵 30 g/L，0.10 Mpa灭菌15 min。 　　2.1.2 HAc-NaAc缓冲液 　　A：称取NaAc?3H2O 27.22 g，加水溶解定容至1，000 mL；B：量取冰醋酸11.46 mL定容至1，000 mL。取A液4.3 mL，B液5.7 mL混合。 　　2.1.3 2%的菊糖溶液 　　菊糖20 g，用上述醋酸缓冲液定容至1 L。 　　2.1.4 DNS试剂 　　取酒石酸钾钠91 g，溶于500 mL水中，向溶液中先加入3，5-二硝基水杨酸3.15 g，加热搅拌使之溶解，再加入苯酚2.5 g，无水亚硝酸钠2.5 g，搅拌使之溶解，冷却后定容1，000 mL，贮存于棕色瓶中，放置一周后使用。 　　2.1.5 还原糖的检测 　　采用DNS法，使用果糖作为标样绘制DNS显色的标准曲线。 　　2.1.6 酶活的测定 　　菊粉酶的活力测定方法依据Pessoni等人的报道进行，酶活力的测定是以菊粉作为底物，取1 mL稀释酶液加入4mL 2%的菊糖溶液（0.2 mol/L，pH4.5的醋酸缓冲液配制），50 ℃反应30 min，以每分钟转化底物产生1μmol还原糖所需的酶量为一个活力单位。酶活的计算方法采用下式计算： 　　2.2 培养方法 　　2.2.1 菌种 　　黑曲霉XY （Asp. niger XY） 是从新沂产菊芋根部的土壤中筛选出来的，采用马铃薯培养基30 ℃培养3 d，4 ℃保藏。 　　2.2.2 酶液的制备 　　取一环斜面菌种孢子分别接入装有50mL产酶培养基的250 mL烧瓶中，30 ℃摇瓶培养60 h。取0.5 mL培养液，pH5.6的醋酸缓冲液稀释20倍，5，000 r/min离心5 min，取上清液测定酶活。 　　2.2.3 菊粉酶培养基的优化 　　以前的初步研究表明，影响菊粉酶产量最为突出的因素为：粗菊芋粉、麸皮和硫酸铵，利用Design Expert软件设计出三因素三水平的响应面实验，并以菊粉酶为响应值，通过实验设计得出各因素的最佳。响应面实验设计的因素与水平表见表1。 　　在表1的基础之上，运用Design Expert软件，设计出了一套实验方案，见表2。通过该表可知，共需要进行17次实验，其中用以估计实验误差的零点实验需要重复5次。 　　3 结果与讨论 　　根据表2的实验结果，运用Design Expert软件进行多元二次回归拟合，得到了菊粉酶产量（Y）对自变量X1、X2和X3的三元二次多项回归方程： 　　Y=181.76-4.26A+10.49B-9.80C+0.78AB-5.10AC-4.05BC-18.27A2-20.32B2-24.09C2。 　　对该回归模型进行方差分析，结果见表3。由表3可以看出，对果菊粉酶构建的模型显著性较高（P值 　　Fig.3 Effects of bran and （NH4）2SO4