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原代大鼠胰岛分离纯化及功能鉴定 　　摘要：目的探讨成年大鼠胰岛分离、纯化的方法，为成人胰岛的分离纯化奠定基础。方法通过用胶原酶P消化胰腺及利用Histopaque 1077分离液离心分离纯化雄性SD大鼠胰岛，用双硫棕（DTZ）染色，吖啶橙碘化丙啶（AO/PI）染色和胰岛素分泌实验来鉴定胰岛的纯度、活性和功能；利用激光共聚焦技术检测胰岛细胞中钙离子浓度。结果分离获得的胰岛可被DTZ和AO/PI分别染成猩红色和绿色；体外刺激胰岛素分泌实验，2.8 mM、8.3 mM、16.7mM葡萄糖情况下胰岛素分泌量分别是：（11.7 ± 1.4）uIU/mL、（38.2 ± 8.7）uIU/mL、（86.3 ± 5.1）uIU/mL；在2.8 mM葡萄糖基础上，8.3 mM葡萄糖明显增加胰岛细胞中钙离子浓度，16.7 mM葡萄糖在8.3 mM葡萄糖基础上又进一步升高钙离子浓度。结论采用胶原酶P消化法及Histopaque 1077分离液离心分得的胰岛纯度高，活性、功能良好，随着葡萄糖浓度的增加，胰岛细胞中钙离子浓度明显增加。 　　关键词：胰岛；分离；钙离子；原代大鼠 　　中图分类号：R329.2R256.2文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn2014.03.051文章编号2014　　老年人是糖尿病高发人群，在全部心脑血管病死亡的病例中，除直接与糖尿病有关外，其余13%的病例与高血糖有关，高血压合并糖尿病成为脑卒中死亡的重要原因[1]。近年来有关糖尿病治疗研究引起了人们的关注，其中有很多胰岛移植的研究。随着分子生物学技术的发展，虽然各个方面取得了很大进步，但其移植效果并不理想，在人体的胰岛移植中，活性能保持一年以上不超过40%[2]。其主要原因是胰岛分离纯化后活性不高，移植后的排斥反应以及免疫抑制剂对大鼠胰岛的毒性作用[3]。因此获得足量、活性良好的胰岛非常重要。本实验采用胶原酶P消化胰腺及Histopaque 1077分离液直接离心分得大鼠胰岛，并对其活性及功能进行评价。 　　1材料与方法 　　1.1动物雄性SD大鼠，体重250 g～300 g，由山西医科大学实验动物中心提供。 　　1.2试剂胶原酶P购自瑞士罗氏公司；双硫棕（DTZ）、HEPES、葡萄糖、多聚赖氨酸（分子量15～30万）购自美国Sigma公司；1640培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司；DispaseⅡ购自美国Amresco公司；青链霉素（双抗）购自北京索莱宝公司；AOPI购自南京建成生物科技有限公司；大鼠胰岛素放射免疫试剂盒购自北京北方生物技术研究所。 　　1.3主要仪器超净工作台（北京世安科技林净化技术有限公司）；CO2细胞培养箱（北京博奥恒信生物科技有限公司）；台式冷冻离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；奥林巴斯激光共聚焦显微镜IX81（日本奥林巴斯IX51）。 　　1.4方法 　　1.4.1原代大鼠胰岛及胰岛细胞分离培养无菌条件下，大鼠断头处死，迅速打开胸腹，在胆总管汇入十二指肠的入口处用止血钳夹住，经胆总管缓慢注入13 mL 4 ℃的1 mg/mL胶原酶P溶液，38 ℃水浴消化11 min，取出立即加入20 mL 4℃培养液（含10%胎牛血清）终止消化，剧烈振摇胰腺至细沙状，用孔径350 μm的滤网过滤，1 200 r/min，离心2 min，去上清，加入10 mL分离液Histopaque 1077至管中重悬组织，将10 mL 1640培养基慢慢顺管壁注入管中，3 200 r/min，离心23 min。收集界面间的悬浮胰岛，在含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素的1 640培养基中培养，并置于37℃，5% CO2，100%湿度的孵箱中培养[4]。将胰岛用含3 mmol/L EDTA的无钙镁PBS溶液脱钙后，加入DispaseⅡ（5 mg/mL）酶液，培养箱孵育6 min，用4℃培养液终止消化，吹打使胰岛分散，1 000 r/min，离心2 min，将胰岛细胞接种在培养皿中，按胰岛培养条件培养[4]。 　　1.4.2大鼠胰岛的DTZ纯度鉴定DTZ 10 mg溶于10 mL DMSO，用Hanks液（pH7.8） 1∶1 000稀释，0.22 μm孔径滤膜过滤，与胰岛制备物混合，室温10 min后镜检[5]；大鼠胰岛的AO/PI活性鉴定：用Hanks液配制储存液，AO：670 μmol/L，PI：750 μmol/L，4 ℃避光保存，使用前取0.01 mL AO与1 mL PI 混合，用Hanks液10倍稀释，0.22 μm孔径滤膜过滤，与胰岛混合10 min，在荧光显微镜下采用490 nm激发光，510 nm发射光镜检[6]。 　　1.4.3胰岛素分泌