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过表达RI对膀胱癌移植瘤生长影响 　　摘要：目的 探讨过表达核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor，RI)基因对膀胱癌裸鼠移植瘤生长及血管表达的影响。方法 实验分三组：T24-RI细胞组（过表达RI的T24细胞细胞组)、T24vector组(转染阴性对照质粒的T24细胞)、T24组(正常T24细胞)。将pcDNA3.1-RI、pcDNA3.1-分别转染人膀胱癌T24细胞,筛选稳定表达的T24细胞,将其注入裸鼠皮下,检测裸鼠移植瘤的大小和质量,HE染色观察移植瘤组织的形态学变化,利用免疫组化技术检测移植瘤组织中微血管的变化。结果 T24-RI组较T24 vector组与T24细胞未转染质粒组,瘤体质量显著降低（P＜0.01）。T24-RI组癌细胞较T24 vector组与未转染质粒组体积减小,T24-RI组微血管较T24 vector组与T24组明显减少。结论 过表达人核糖核酸酶抑制因子基因RI，可以抑制膀胱癌裸鼠移植瘤的生长。 　　关键词：核糖核酸酶抑制因子；膀胱癌；血管生成素；真核表达 　　人核糖核酸酶抑制因子是一个分子量为50kD的酸性蛋白，它具有7个亮氨酸残疾重复片段组成的亮氨酸拉链（LRRs）结构。RI的功能就是识别并结合核糖核酸酶A，从而抑制其活性。具有LRR重复结构的一百多种蛋白显示的包括DNA修复，细胞外基质相互作用，周期调控，信号传导在内的多种生物学功能[1-4]。根据结构基因组学，我们推断RI具有我们尚未发现的其他生物学功能。本实验通过构建的过表达RI的载体，转染并筛选稳定表达的克隆。从动物体内试验探索RI基因的质粒对人膀胱癌生长的影响及其可能存在的机制。 　　1材料与方法 　　1.1主要材料和试剂膀胱癌T24细胞，T24 vector细胞，T24-RI细胞均来自本实验室保存：SPF级BALB/C裸鼠购于北京大学动物实验中心，由重庆医科大学动物中心代为饲养。 　　兔抗人RI一抗由本实验保存；免疫组化染色试剂盒，BAD染液购于北京中衫金钱生物技术有限公司。 　　1.2裸鼠移植瘤模型的构建立即将取下的瘤重一半放入液氮，一半放入4%多聚甲醛溶液中保存。抑制率=(1-实验组瘤重/对照组瘤重)×100%；解剖裸鼠取肺部组织，放入4%多聚甲醛溶液中固定保存，用于HE染色观察肺组织转移情况。 　　1.3移植瘤肺组织，瘤组织HE染色 取4%多聚甲醛溶液固定的各组肺，瘤组织及人体膀胱癌组织，石蜡包埋，10μm切片。 　　1.4组织免疫荧光取液氮冻存的瘤组织，切片，冷丙酮固定，通透，BSA封闭，一抗CD31（1:100稀释），4℃孵育过夜，PBS洗3遍，羊抗兔Dylight 488标记的山羊抗兔IgG（1:50）37℃避光孵育2h，PBS洗3遍，封片。于荧光显微镜下拍照。 　　1.5统计学分析采用SPSS 10.0软件进行统计处理，数据以（x±s）表示，组间比较行方差分析及q检验。 　　2结果 　　2.1过表达RI对裸鼠移植瘤生长的影响T24组，T24 vector组，T24-RI组细胞注射裸鼠，35d后处死取瘤记重。T24组，T24 vector组，T24-RI组平均瘤重分别为（0.2727±0.073），（0.2635±0.164），（0.081833±0.062）。T24-RI组移植瘤的生长受到明显抑制，同T24组，T24 vector组比较，抑制率分别为25.67% 和 37.85%。 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 图1成功构建裸鼠移植瘤 　　 a 裸鼠移植瘤；b 裸鼠成瘤质量分析 　　2.2组织免疫荧光观察各组移植瘤血管的变化如图2，CD31抗体在T24-RI组中弱阳性，在T24组，T24 vector组成强阳性，表明T24-RI组移植瘤中微血管的明显少于T24组，T24 vector组。 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 　　 图2CD31检测瘤组织微血管生成情况 　　2.3肺组织HE染色检测各组癌细胞转移情况T24-RI组肺组织未见明显转移， T24组，T24 vector组在血管周围均可见到细胞核增大，细胞核染色加深的细胞团，表明癌细胞向肺组织转移。 　　3讨论 　　将T24，T24 vector，T24-RI三组细胞皮下注射裸鼠后，取形成的移植瘤称重发现，T24-RI组瘤重明显轻与其他两对照组，HE染色结果显示，两对照组中细胞核染色加深，核质比例加大，核分裂相增多，微血管明显多于T24-R