耐辐射球菌ppri和tat-ppri蛋白在毕赤酵母中的表达及其抗辐射作用与机理的研究-expression of ppri and tat - ppri proteins in pichia pastoris and their anti-radiation effects and mechanisms.docxVIP

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2018-07-27 发布于上海
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耐辐射球菌ppri和tat-ppri蛋白在毕赤酵母中的表达及其抗辐射作用与机理的研究-expression of ppri and tat - ppri proteins in pichia pastoris and their anti-radiation effects and mechanisms

苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定， P: 学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所(含万方数据电子出版社)、中国学术期刊(光盘版)电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文挡，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属 .在一一一年一-月解密后适用本规定. 非涉密论文口I 论文作者签名:他怕日期: 20/6 .5.且导师签名: AD\ ‘斗之句日期: 耐辐射球菌 Pp 耐辐射球菌 PprI 和 TAT-PprI 蛋白在毕赤酵母中的表达及其抗辐射作用与机理的研究中文摘要中文摘要耐辐射球菌 P 中文摘要耐辐射球菌 PprI 和 TAT-PprI 蛋白在毕赤酵母中的表达及其抗辐射作用与机理的研究中文摘要目的：耐辐射球菌是一种对电离辐射、紫外线等辐射引起的致死和突变效应具有极强抗性的微生物。这类超强的辐射抗性和它自身拥有的完善高效的DNA损伤修复通路密切相关。PprI是耐辐射球菌中一个独有的功能蛋白，它在DNA损伤修复的复杂调控中起着关键作用，被认为是耐辐射球菌DNA损伤修复通路的靶开关。耐辐射球菌发现50余年来，耐辐射球菌PprI蛋白对原核生物的辐射防治作用及其抗辐射机制已有较深入的研究。本课题则研究在真核系统中高效表达和纯化 PprI和TAT-PprI蛋白的方法，并且探讨其在真核细胞中的抗辐射作用和机制，为急性放射损伤的临床防治提供有价值的实验资料，迄今尚未见国内外报道。材料与方法：本实验以本课题组吴伟硕士构建的pHBM905A-His-PprI载体和乔惠萍博士构建的pPICZα A-TAT-PprI载体为模板，在毕赤酵母表达系统中优化表达和纯化条件，旨在获得大量的耐辐射球菌PprI蛋白和TAT-PprI蛋白。以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为作用对象，应用免疫荧光实验观察PprI和TAT-PprI蛋白在细胞内的分布情况，应用CCK-8法检测PprI和TAT-PprI蛋白对HUVEC毒性和辐射细胞增殖的影响，应用克隆形成实验检测PprI和TAT-PprI蛋白对辐射细胞存活的影响。抗氧化实验应用荧光探针DCFH-DA检测PprI和TAT-PprI蛋白对受照HUVEC ROS水平的影响，同时应用抗氧化试剂盒检测PprI和TAT-PprI蛋白对受照HUVEC 超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量的影响。细胞凋亡实验应用流式细胞仪检测PprI和TAT-PprI蛋白对HUVEC凋亡的影响，同时应用免疫印迹检测PprI和TAT-PprI蛋白对线粒体凋亡通路相关蛋白（Bcl-2、Bax）表达的影响。DNA损伤修复实验应用免疫荧光实验观察PprI和 TAT-PprI蛋白对受照HUVEC γH2AX焦点数的影响，同时应用免疫印迹检测PprI 和TAT-PprI蛋白对真核生物重组修复蛋白（Rad51）表达的影响。结果： 1. 成功优化了耐辐射球菌PprI和TAT-PprI蛋白的表达及纯化条件，一次培养高效获得了5 mg耐辐射球菌PprI蛋白和5 mg TAT-PprI蛋白。 I PAGE IV PAGE IV PAGE III PAGE III 2. 与普通的耐辐射球菌PprI蛋白相比，TAT-PprI蛋白具有较强的跨膜能力，进入细胞主要与细胞器和细胞核作用。 3. 细胞毒性实验结果显示，耐辐射球菌PprI和TAT-PprI蛋白分别在0-10、0-25 μg/mL的浓度范围内对HUVEC无毒性作用（P＞0.05）。PprI蛋白浓度大于20 μg/mL 时对HUVEC的生长产生抑制作用（ P0.05），PprI蛋白与HUVEC作用24、48、 72 h细胞的半抑制率IC50值分别为63.58、51.80、32.46 μg/mL；TAT-PprI蛋白浓度大于50 μg/mL时对细胞的生长产生抑制作用（ P0.05），TAT-PprI蛋白与HUVEC 作用24、48、72 h细胞的半抑制率IC50值分别为107.90、97.26、87.55 μg/mL。 4. 细胞增殖实验结果显示PprI和TAT-PprI蛋白浓度在0.8-8 μg/mL时对受照细胞的增殖有明显的促进作用（P0.05~0.001）。 5. 辐射细胞存活曲线显示，细胞吸收剂量为2、4、6、8 Gy时，PprI和TAT-PprI 蛋白作用组的辐射细胞存活分数均高于单纯照射组，结果具有显著性统计学