条斑紫菜原生质体转基因的研究.pdfVIP

磊斑紫菜原生质体转基目的研究 第一章文献综述 海洋是巨大的生物资源宝库，人类越来越多地认识到开发利用海洋的重大 意义。海藻是生长于海洋的低等植物，约三万多种，处于海洋生态链最底层，能 将无机物质转化为复杂的有机物质，每年每平方千米的藻类能制造出375吨有机 碳，并在光合作用过程中放出大量氧气，供给鱼类等海洋动物的需要，维持海洋 渔业资源的持续发展与利用。生态学及生源学的研究结果表明，低级海洋生物如 藻类及其共生菌类是海洋生物活性物质最主要的初始来源【”，是蛋白质，维生索， 微量元素和藻胶的供给者，尤为令人瞩日的是它们含有多种生理活性物质，具有 重要的营养保健作用，能提供食品、纺织印染、医药卫生等行业的需要。 因此随着人类对海洋资源研究开发的日益深入，藻类生物技术已成为当代 海洋生物技术的主要研究领域之一。利用藻类基因工程改造品种或以藻类为生物 反应器生产蛋白多肽类药物、饵料等具有广闼的前途。 1．藻类基因工程的研究进展 70年代以来，海洋原核藻类蓝藻遗传转化的成功拉开了海藻基因工程研究 眙序幕。目前海洋蓝藻基因工程研究得到广泛而深入的开展，围绕基因工程所开 展的基因克隆、定位、功能分析和表达调控研究已成为蓝藻分子遗传学研究的热 点。继彳M6∞wAlc7120之后，海洋蓝藻SynechococcusPCC7002的染色体物 理图谱也已完成；蓝藻内源性质粒的广泛存在为其基因工程研究中载体的构建提 供了良好基础【2】。现在围绕人工构建藻类新品种和实现藻类天然产物的基因工程 生产两个根本目标，海洋蓝藻基因工程向应用目标迈出了重要的一步。 7口∞的藻蓝蛋白基因已在大肠杆菌中得到成功表达，目的基 两,nechococcusPCC 因同样在跏日Eb口∞c口HⅣ℃7002中得到稳定转化．蓝藻分子遗传学研究成果显 著，积累了大量藻类基因工程研究的理论与技术，这为海洋真核藻类基因工程的 发展奠定了怠好基础，但由于两者分子生物学特性存在本质区别，所以在基因工 程载体构建，外源基因转移系统等各个方面都有显著差异【3l。真核藻类遗传转化 reinhardtii的遗传转化，选用壁缺失突变和精 藻—莱茵哈特衣藻Chlamydomonas 条斑紫菜原生质体转基因的研究 氨酸依赖突变株，使来自酵母的精氨酸基因获得了整合表达的效果．其后，C． reinhardii广泛应用于分子遗传学与基因工程研究，目前已成为唯一的染色体、 叶绿体、线粒体三套基因组均能遗传转化的植物141。大型海藻如红藻，褐藻，绿 藻等的遗传转化研究处于刚刚起步阶段，并且各种藻类遗传特性不同，研究水平 也不均衡。 藻类基因工程的研究落后于高等陆生植物，在许多方面是在借鉴高等植物的 转基因方法的基础上发展起来的。与高等植物类似，藻类的基因工程也涉及到以 下几个方面：(1)表达载体的构建；(2)基因转化的方式；(3)藻类的组织培养 技术及转化后藻体的再生；(4)转基因藻体的鉴定。 1．1表达载体的构建 高等植物的转化载体分为生物性转化载体和物理转化载体。所谓生物性载体 主要指的是农杆菌载体系统，由于农杆菌的天然宿主有一定的范围，尽管随着研 究深入，越来越多的生物体可以通过这种方法实现转化，但是农杆菌介导的转化 还未拓展到藻类转基因领域。 利用物理方法将DNA转移至植物一直与农杆菌转化体系平行发展的。在早 期的物理转化实验中是以农杆菌质粒为载体的，现在已被不含植物转移元件的载 体所代替。物理性转化载体起大小通常在4—7kb之间。9kb—llkb的载体也不 影响转基因的稳定性。物理转化载体由于不受转化方法的限制而独树一帜，最简 单的载体由基本的植物表达元件和植物选择标记组成，它们插入基本的克隆载体 上，基本的克隆载体可提供大肠杆菌复制子和细菌选择标记。不论载体如何构建， 必须包括以下几个成分(1)选择标记基因表达盒，即5’调控区(启动子)一选 择标记基因一3’调控区(终止子)嵌合基因(其中的调控区在转化的受体细胞能 起作用)；(2)外源基因和或报告基因表达盒，即5’调控区(启动子)一外源或 者报告基因一3’调控区(终止子)嵌合基因；(3)细菌宿主的复制起点及细菌选 择标记等。作为细菌宿主的复制起点及细菌选择标记是每一个质粒载体都具备 的，是进行复制和扩增所必备，来源于质粒骨架。因此以下主要介绍藻类选择标 记嵌合基