木瓜凝乳蛋白酶的分离纯化及应用基础分析-separation, purification and application analysis of chymopapain.docx

摘要 摘要 木瓜凝乳蛋白酶( Chymopapain) 是木瓜蛋白酶粗品中含量最高的 一种酶， 具有凝乳和蛋白水解能力，在治疗骨质增生、肿瘤的辅助治疗、 Rh 血型鉴定、 抗炎治疗、细胞分离等方面有非常重要的用途。由于番木瓜乳汁中含有的四种颈 基蛋白酶在结构、性质等方面十分相似，因而分离木瓜凝乳蛋白酶比较困难。尽 管目前己能分离到纯木瓜凝乳蛋白酶，但分离方法的步骤都较为繁琐，不仅对酶 的分离不利而且仅适用于小规模制备。本研究从木瓜蛋白酶粗品中利用离子交换 层析和超滤两步分离，冷冻干燥后得到术瓜凝乳蛋白酶，简化了分离步骤，对于 木瓜凝乳蛋白酶的大规模生产有着重要的意义。 近年来研究报道木瓜蛋白酶可用于癌症放化疗的辅助治疗。由于木瓜凝乳蛋 白酶在结构上比木瓜蛋白酶多一个自由的琉基，具有水解活性高、耐酸及热稳定 性好等特点，因此具有更高的药用价值。 本研究用 MTT 法分析了木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶与五种化疗药物，即 5-氟尿日密院( 5-Fu) 、氨甲喋岭(MTX)、平阳霉素(PYM)、长春新碱(VCR) 和卡铅( CBP) ，单独或联合使用对小鼠腹水型肝癌 HZ2 细胞的杀伤作用，发现 木瓜凝乳蛋白酶对 H22 细胞的杀伤作用高于木瓜蛋白酶:木瓜凝乳蛋白酶与五种 化疗药物对 H22 细胞的协同杀伤作用均呈浓度依赖性:木瓜凝乳蛋白酶对五种化 疗药物均具增敏作用。在加药培养至 48h 时，酶对五种化疗药物杀伤肿瘤细胞的 促进效果达到最佳。 利用 MTT 法测定木瓜凝乳蛋白酶和 5-Fu 、MTX 单独或联合使用对人肝癌细 胞 BEL-7402 的杀伤作用，得出:木瓜凝乳蛋白酶对人肝癌细胞 BEL-7402 的杀 伤作用呈浓度依赖性:选取对 BEL刁402 细胞无明显杀伤作用的木瓜凝乳蛋白酶 浓度，与 5-Fu 或 MTX 两种化疗药物联合使用，比化疗药物单独使用对 BEL-7402 细胞的杀伤作用更大，即木瓜凝乳蛋白酶能增强 5-Fu 和 MTX 对 BEL-7402 的杀 伤作用。 初步观察木瓜凝乳蛋白酶和 5-Fu 联合用药对 BALB/c 小鼠抗肝癌腹水肝癌 Hn 的治疗作用，发现木瓜凝乳蛋白酶与 5-Fu 联合使用可以延长腹水肝癌小鼠的 生存期，并减少 5-Fu 对小鼠的毒副作用。 Rh 血型系统是是临床上重要的血型系统之一。 Rh 抗原有 40 多种类型，主 要的是 RhD ，RhC/c ，RhE/e 。用分离得到的木瓜凝乳蛋白酶进行Rh 血型鉴定、 IgG 抗 D 抗体效价测定、抗体特异性鉴定和交叉配血试验，并均与传统抗人球 蛋白法作对照，结果一致，表明木瓜凝乳蛋白酶可应用于 Rh 血型的诊断。 华南理工大学博士学位论文 本文用两步法从木瓜蛋臼酶粗品中分离纯化得到纯木瓜凝乳蛋白酶，为工业 化生产提供了一个较为简单而有效的模式:首次进行了木瓜凝乳蛋白酶对鼠肝癌 细胞株和人肝癌细胞株的杀伤作用研究，并与化疗药物一起联合使用，发现了酶 对化疗药物具有增敏作用，体内实验又初步证明木瓜凝乳蛋白酶与化疗药物合用 可以延长腹水瘤小鼠的生存期，并减少化疗药物的毒性，这些均为临床用药提供 了理论和实验依据。分离得到的术瓜凝乳蛋白酶可用于 Rh 血型血清学研究，为 Rh 血型的诊断提供了新材料。 关键询:木瓜凝乳蛋臼酶:纯化:抗肿瘤; Rh 血型诊断 E ABSTRACT ABSTRACT Chymopapain is one of the most abundant enzymes in the crude papain ，which has milk clotting and proteolytic activities. Chymopapain has very important application in hyperosteogeny treatment ，identification of Rh blood group，accessory therapy of cancer，inflammatory disease treatment ，cell separation. It is very difficult to isolate chymopapain from the latex of Caricα papaya because chymopapain is very similar to the other three cysteine proteinases in the latex at the structure and properties . The isolation steps were complex and only can be used in