沙门菌生物膜形成的影响因素及机制分析-analysis on influencing factors and mechanism of salmonella biofilm formation.docxVIP

中文摘要第一部分鼠伤寒沙门菌质粒对细菌生物膜形成的影响目的：鼠伤寒沙门菌（Salmonellatyphimurium，S.typhimurium）在多种物体表面形成的生物膜（Biofilm，BF）对增强其致病性有重要作用。本研究探讨鼠伤寒沙门菌SR-11携带的100kb质粒对细菌在不同材质表面BF形成的影响，为后续进一步探讨该质粒的致病机制及抗菌药物的研制提供理论和实验依据。方法：1.BF形成适宜培养基的选择以携带质粒的鼠伤寒沙门菌野生株SR-11为受试菌，将对数生长期菌液分别接种于含肉汤培养基（Luria-Bertani，LB）和胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TryptoseSoyaBroth，TSB）的聚苯乙烯96孔培养板及置小圆玻片于底部的24孔培养板，30℃培养6h、12h、24h和48h后用结晶紫半定量法比较在聚苯乙烯培养板与玻片表面BF形成的适宜培养基。2.带有绿色荧光蛋白GFP菌株的构建及生长曲线的测定参照文献将GFP基因导入携带100kb质粒的鼠伤寒沙门菌野生株SR-11和将该质粒消除后的突变株，构建带有绿色荧光蛋白GFP标记的发光菌。将对数生长期菌液稀释后涂布于含100μg/ml氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）的LB固体培养基上，荧光显微镜下观察。用构建的野生株与突变株单克隆分别接种于LB培养基后测定细菌生长曲线。3.鼠伤寒沙门菌质粒对细菌在不同材质表面BF形成的影响按上述条件，将野生株和突变株分别在聚苯乙烯培养板与玻片表面建立BF模型。结晶紫半定量法比较受试菌6h、12h、24h和48h在两种材质表面BF形成的差异；共聚焦激光扫描显微镜（Confocallaserscanningmicroscopy，CLSM）断层扫描，比较受试菌在玻片表面BF的形成。结果：1.BF形成适宜培养基的选择结晶紫半定量法结果显示，野生株在聚苯乙烯培养板和玻片两种材质表面用LB培养基各时间点的OD590值均高于TSB培养基，说明LB培养基更适宜BF的形成，在后续实验中即选择LB培养基。2.带有绿色荧光蛋白GFP菌株的构建及生长曲线的测定荧光显微镜检测结果显示，用Amp选择培养基能筛选出表达GFP的野生株与突变株。与未导入GFP基因的菌株相比，细菌生长曲线未受明显影响。3.鼠伤寒沙门菌质粒对细菌在不同材质表面BF形成的影响结晶紫半定量法结果显示，6h、12h、24h和48h聚苯乙烯培养板表面生长的野生株与突变株OD590值均未见统计学差异（P0.05）；在玻片表面生长的野生株OD590值各时间点均高于突变株（P0.01）；野生株和突变株更易在聚苯乙烯培养板表面形成BF。CLSM观察结果显示，30℃静态培养48h后，野生株在玻片表面可形成融合成片的菌膜，平均厚度和最大厚度分别是25μm与30μm；突变株仅形成稀疏的菌落，平均厚度和最大厚度分别为15μm与18μm。结论：鼠伤寒沙门菌SR-11携带的100kb质粒能促进宿主菌在玻片表面BF的形成，但对聚苯乙烯培养板表面BF的形成未见明显影响，说明BF的形成除与细菌的胞外黏附成份相关外还与其生成的材质表面结构相关。关键词：鼠伤寒沙门菌；质粒；生物膜第二部分胞外DNA对沙门菌生物膜形成的影响及其机制研究目的：通过检测鼠伤寒沙门菌SR-11与伤寒沙门菌ST6生物膜（Biofilm，BF）胞外DNA（ExtracellularDNA，eDNA）的含量及来源，研究其在细菌BF形成和维持BF结构稳定性中的作用，为后续防治沙门菌感染、抗菌药物和消毒剂的研制提供理论和实验依据。方法：1.BF中eDNA的检测(1)eDNA的分子量测定和定量分析将对数生长期的SR-11和ST6菌液接种于含LB肉汤的聚苯乙烯6孔板，30℃静态培养，于6h、12h、24h和48h用细胞刮刀收集BF样本，分别用蛋白酶K和纤维素酶消化提取eDNA，琼脂糖凝胶电泳法测定eDNA的分子量并用紫外分光光度计对eDNA进行定量分析。CLSM观察eDNA在BF中的定位将对数生长期的SR-11与ST6菌液接种于含LB培养基的24孔板中，置小圆玻片于24孔板底部，30℃静态培养48h。DDAO[7-hydroxy-9H-(1，3-dichloro-9，9-dimethylacridin)，DDAO]染色后用CLSM观察荧光颜色的变化以确定eDNA在BF中的定位。2.eDNA对细菌BF形成及三维结构的稳定作用(1)微量平板法将对数生长期的SR-11和ST6菌液接种至含LB培养基的聚苯乙烯96孔培养板中，同时加入终浓度为50μg/ml的DNaseI，另设未加DNaseI作阴性对照，30℃静态培养48h。结晶紫半定量法分别在6h、12h、24h和48h各时间点检测DNaseI对BF形成的影响。将对数生长期的SR-11和ST6菌液接种至含LB培养基