沙门菌质粒毒力基因spvb抗体的制备及其对nf-κb通路的影响-preparation of antibody against salmonella plasmid virulence gene spvb and its influence on nf - κ b pathway.docxVIP

中文摘要沙门菌质粒毒力基因spvB抗体的制备及其对NF-κB通路的影响时转染HeLa细胞，TNF-α刺激后，Westemblot检测spvB基因对TKBα、p65等蛋白表达的影响。结果：一.沙门菌质粒毒力基因spvB抗体的制备1.成功构建pET28a-SpvB原核表达重组质粒，经TPTG诱导结果显示，重组蛋白表达且主要存在于包涵体中。2.将纯化的SpvB蛋白免疫小鼠，制备多克隆抗体，经Westemblot验证该抗体能特异结合SpvB蛋白。二．沙门菌质粒毒力基因spvB对NF-KB通路的影响1.Westemblot检测NF-KB通路相关蛋白TKBα和p65的表达，结果显示细菌与细胞共培养30mim后，STM-ΔspvB感染组细胞TKBα的表达量显著低于STM-WT感染组（P0.01），与STM-c-ΔspvB感染组相比两组间无显著性差异（P0.05）；感染4h后，STM-ΔspvB感染组TKBα的表达量显著低于STM-WT和STM-c-ΔspvB感染组（P0.01）；感染4h和8h后，STM-ΔspvB感染组Phospho-p65的表达水平高于STM-WT和STM-c-ΔspvB感染组（P0.05）。2.荧光显微镜下观察p65的核转运，结果显示感染8h后，STM-ΔspvB感染组细胞核中p65的表达显著高于STM-WT和STM-c-ΔspvB感染组。3.Westemblot检测Caspase-3的激活，结果显示感染4h和8h后，STM-WT和STM-c-ΔspvB感染组细胞Caspase-3出现明显的活化；比色法测定Caspase-3的活性，结果显示感染4h和8h后，STM-WT和STM-c-ΔspvB感染组细胞Caspase-3活性高于STM-ΔspvB感染组（p0.01）。4.免疫共沉淀检测TKBα的泛素化水平，结果显示用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞24h，细菌与细胞共培养4h后，STM-ΔspvB感染组TKBα的泛素化水平高于STM-WT和STM-c-ΔspvB感染组，而未经MG132处理各组间TKBα的泛素化差异不明显。5.双荧光素酶报告基因检测系统检测spvB对NF-KB通路的影响，结果显示pEGFP-N1或pEGFP-N1-SpvB瞬时转染HeLa细胞24h，TNF-α处理后，pEGFP-N1-SpvB转染组NF-KB的激活程度显著低于pEGFP-N1转染组（P0.01）；pRL-TK、pNFKB-luc转染HeLa细胞24h，三株受试菌感染细胞20h后，STM-ΔspvB感染组NF-KB的激活程度显著高于STM-WT和STM-c-ΔspvB感染组（P0.01）。TT沙门菌质粒毒力基因spvB抗体的制备及其对NF-κB通路的影响中文摘要6.Westemblot检测spvB基因对TKBα和p65等蛋白表达的影响，结果显示利用pEGFP-N1-SpvB真核表达载体瞬时转染HeLa细胞，TNF-α处理后，pEGFP-N1-SpvB质粒转染组Phospho-p65的表达显著低于pEGFP-N1转染组（P0.01）而TKBα的表达显著高于pEGFP-N1转染组（P0.01）。结论：1.成功构建SpvB原核表达载体，获得具有抗原性的SpvB蛋白及其多克隆抗体，为后续深入研究该基因的功能奠定了基础。2.利用沙门菌感染巨噬细胞和真核表达载体pEGFP-N1-SpvB转染的HeLa细胞模型，证实spvB抑制NF-KB通路的激活，为进一步探索spvB基因影响细菌毒力的分子机制提供理论和实验依据。关键词：鼠伤寒沙门菌；毒力基因spvB；抗体；NF-KB作者：燕婧指导老师：黄瑞英文摘要沙门菌质粒毒力基因spvB抗体的制备及其对NF-κB通路的影响Preparationofanti-SpvBantibodyandtheinfluenceofspvBgeneonNF-κBsignalingpathwayAbstractObjective:TheviulemcefactoemcodedbySalmonellaplasmidviulemcegemespvBpossessesADP-ibosyltamsfeaseactivity，whichiscloselyelatedwithbacteialviulemce.Howeve，itsexacteffectomhostcellfumctiomemaimselusive.ToimvestigatethemoleculamechamismsofspvBgemeombacteialpathogemic，wefistlycomstuctedthepokayoticplasmidexpessimgspvBgemeamdpepaeitsamtibody，whichpovideatoolfofutheimvesti