沙门菌毒力基因spvb抑制细胞自噬分子机制及对斑马鱼感染模型影响-mechanism of salmonella virulence gene spvb inhibiting autophagy and its influence on zebrafish infection model.docxVIP

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沙门菌毒力基因spvb抑制细胞自噬分子机制及对斑马鱼感染模型影响-mechanism of salmonella virulence gene spvb inhibiting autophagy and its influence on zebrafish infection model

3.共聚焦激光显微镜观察细胞骨架、蛋白与细菌的共定位将细胞铺入含小圆玻片的24孔板中,于细胞培养箱中培养至对数生长期,分别转染EGFP-Beclin-1、EGFP-Atg14和pGFP-ZFYVE1质粒,与细菌共作用1h后,用鬼笔环肽(phalloidin)染色细胞骨架,呈现红色,利用沙门菌特异性抗体与荧光二抗结合后对细菌进行着色,将细菌标记为蓝色,借助共聚焦激光显微镜观察细胞骨架、蛋白与细菌三者的共定位。4.荧光显微镜下观察p62与感染细菌共定位收集感染后1h的细胞,抗体孵育后,荧光显微镜下观察各感染组中细菌与p62蛋白共定位情况,计算共定位的细菌占侵入细胞内细菌总数的百分比。5.Westernblot法检测自噬相关蛋白和p70S6K磷酸化的水平收集感染后1h和2h的细胞,采用蛋白免疫印迹(Westernblot,WB)法检测自噬相关蛋白LC3,p62和Beclin-1的表达水平;在RAPA和Baf药物干预后,观察不同感染组之间自噬相关蛋白表达水平的变化。收集感染后1h和3h的细胞,Westernblot法检测mTOR信号通路下游p70S6K蛋白表达水平,分析各不同感染组之间磷酸化表达水平的变化。6.平板计数法计算胞内活菌数收集感染感染后30min、1h、3h和5h的HeLa细胞,计算细胞胞内菌落形成单位(colony-formingunit,CFU)。平板菌落计数法分别记录不同感染组中胞内菌的个数。二.沙门菌毒力基因spvB对斑马鱼感染模型自噬和肠道病变的影响由于回补株STM-c-ΔspvB需用L-阿拉伯糖诱导才能表达,不适合用于体内实验,所以本课题第二部分只选用鼠伤寒沙门菌STM-WT和STM-ΔspvB作为体内实验菌株。1.构建斑马鱼肠道感染模型选取受精后5dp(fdayspost-fertilization,dpf)的斑马鱼幼鱼,用Holtfreterbuffer将菌液稀释至1×109cfu/ml、1×108cfu/ml、1×107cfu/ml、1×106cfu/ml、1×105cfu/ml、1×104cfu/ml,采用浸染法感染6hpi(hourspostinfection,hpi)后,将斑马鱼放入Holtfreterbuffer中,统计感染后7d斑马鱼的死亡数目,绘制存活率曲线,计算半数致死量(medianlethaldose,LD50)以确定感染最适浓度及不同菌株对斑马鱼生存的影响。2.平板菌落计数法分析细菌在斑马鱼体内的侵袭及播散能力收集6hpi、24hpi、72hpi和120hpi幼年斑马鱼,利用平板菌落计数法计算斑马鱼全鱼体内细菌量,同时进行阿米卡星(Amikacin,AMK)杀菌实验,计数杀死胞外菌后,入侵到斑马鱼胞内的活菌数,检测细菌的播散能力及体内繁殖情况。3.检测斑马鱼体内自噬水平收集感染不同时间点的斑马鱼,检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1和P62的表达,比较鼠伤寒沙门菌STM-WT和STM-ΔspvB随感染时间的延长,斑马鱼体内自噬水平的变化;用透射电子显微镜观察两株菌在72hpi斑马鱼肠道超微结构的变化及体内自噬体结构的形成。4.斑马鱼感染后肠道的病理学改变及凋亡水平测定用鼠伤寒沙门菌STM-WT和STM-ΔspvB分别感染5dpf斑马鱼,比较两株菌感染不同时间点对斑马鱼肠道的影响,普通光学显微镜观察斑马鱼肠腔的变化;病理切片HE染色观察肠道粘膜的病理学改变;用Westernblot法检测凋亡相关蛋白Bcl-2的表达,同时采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测斑马鱼体内凋亡调控基因bcl-2的mRNA转录水平。5.检测沙门菌感染斑马鱼后体内炎症反应及巨噬细胞的吞噬功能分别取6hpi、24hpi、72hpi和120hpi的斑马鱼观察细菌感染对斑马鱼炎症反应的影响。qRT-PCR检测TNFα,IL-1β,IL-22和IL-10的mRNA水平。中性红染色法检测斑马鱼体内在不同感染组中随感染时间的延长巨噬细胞吞噬功能的变化。结果:一.沙门菌毒力基因spvB抑制细胞自噬的分子机制1.spvB抑制自噬体形成:用TEM观察STM感染后HeLa细胞的超微结构,结果显示突变株STM-ΔspvB感染后1h出现典型双层膜自噬体结构,随着感染时间的延长,在感染后2h出现单层膜的自噬溶酶体结构,其内包裹着细胞器和一些待降解的物质成分,而在野生株STM-WT和回补株STM-c-ΔspvB感染组中未见到自噬体形成,但可观察到含沙门菌囊泡(Salmonella-containingvacuoles,SCV)和胞内菌明显增多,且随感染时间的延长,细菌数量显著增加。2.spvB抑制自噬体形成的早期阶段:用mRFP-GFP-LC3转染HeLa细胞,通过CLSM观察LC3点状凝集,结果发现突变株STM-ΔspvB感染组

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