深海超嗜热嗜压古菌pyrococcus yayanosii压力适应性机制研究-study on pressure adaptability mechanism of deep-sea hyperthermophilic archaea pylo coccus yayanosii.docx

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深海超嗜热嗜压古菌pyrococcus yayanosii压力适应性机制研究-study on pressure adaptability mechanism of deep-sea hyperthermophilic archaea pylo coccus yayanosii

独创声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含未获得或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名:签字日期:年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,并同意以下事项:1、学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查阅和借阅。2、学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权清华大学“中国学术期刊(光盘版)电子杂志社”用于出版和编入CNKI《中国知识资源总库》,授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名:导师签字:签字日期:年月日签字日期:年月深海超嗜热嗜压古菌Pyrococcusyayanosii压力适应性机制研究摘要深海是典型的高静水压环境,嗜压微生物(piezophile)是深海生态系统中的重要类群。随着深海取样技术的不断发展和深海高压微生物特殊培养装置的研发,已经从深海环境中分离到了多种嗜压微生物,其中包括不能在常压条件下生长的专性嗜压微生物。通过对分布于不同压力范围的微生物近缘种间进行比较而获得的嗜压微生物的压力适应性的认识,不能反映微生物个体水平上对静水压力变化的应激调控机制。本文通过比较严格嗜压菌株与其衍生的兼性嗜压菌株在基因组、转录组及相关生理性状上的差异,试图从微生物细胞的物质代谢与能量转化的角度分析深海嗜压微生物的压力适应性。PyrococcusyayanosiiCH1分离自大西洋中脊4100米水深的“Ashadze”热液口,是目前已知的第一株和唯一一株严格嗜压的超嗜热古菌,其最适生长压力为52MPa,最高耐受压力超过了120MPa。本论文通过人工驯化手段,获得CH1衍生的兼性嗜压菌株A1,其最适生长压力为52MPa,但压力耐受范围变宽,可以在0.1MPa的常压条件下生长。对A1菌株进行全基因组测序,并与CH1进行比较基因组分析,结果表明两个基因组中存在23处序列差异,这些序列差异所在的基因主要与细胞周期调控、鞭毛的合成以及芳香族氨基酸的转运等相关。对A1菌株中相关基因的功能展开研究,将有助于揭示此类深海超嗜热嗜压古菌的压力适应性机制。A1可以在常压下生长,使以该菌株为宿主建立遗传操作系统成为可能。构建了携带A1中pyrF基因侧翼同源序列和受谷氨酸脱氢酶强启动子控制的3-hydroxy-3-methylglutaryl辅酶A(HMG-CoA)还原酶超表达基因元件(SimR)的自杀质粒pLMO02。利用过表达HMG-CoA还原酶赋予A1菌株simvastatin抗性作为标记,成功的中断了A1菌株的pyrF基因(PYCH0296),获得了尿嘧啶缺陷型菌株A2。而且,又构建了SimR-pyrF基因元件,获得了无痕基因中断载体pLMO03。无痕敲除系统突破了A1菌株中可用筛选标记的限制,可以中断A1基因组中的任何非必需基因,并且筛选标记可以重复利用。I单一菌株以甲酸为唯一碳源的产氢呼吸途径仅见于深海超嗜热古菌ThermococcusonnurineusNA1,是最简单的厌氧呼吸方式之一。比较基因组分析表明,Thermococcales科超嗜热古菌中只有ThermococcusonnurineusNA1、ThermococcusgammatoleransEJ3和Pyrococcusyayanosii中存在有完整的甲酸代谢基因簇(Fmr)。中断A1菌株的Fmr基因簇后,突变株中大量积累甲酸,其0.1MPa的生长也受到限制。膜结合态氢酶复合体Mbh以及胞质内氢酶复合体SHI参与了Thermococcales微生物的能量代谢,中断A1菌株的Mbh和SHI基因簇后,突变株中也积累甲酸,表明Mbh和SHI复合体也参与了A1菌株的甲酸代谢。甲酸既是代谢过程中的重要中间代谢产物,也是一些超嗜热微生物肌苷(IMP)合成途径中的一碳单元。对A1菌株在0.1MPa和52MPa压力条件下的转录组分析发现,与IMP合成途径相关的基因转录在0.1MPa压力条件下调,而与甲酸代谢及能量转换相关的氢酶的编码基因则转录上调。该结果暗示,A1中参与IMP合成代谢的甲酸被分解产能以适应低压的胁迫环境。而对于CH1在15MPa和52MPa压力条件下的转录组分析发现,其在15MPa的边界压力下,不能有效的调节甲酸由参与IMP合成向氧化产能转换。进一步对IMP合成途径和甲酸氧化途径相关基因的启动子区域分析,发现IMP

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