水稻缺刻蛋白在水稻齿叶矮缩病毒侵染模式下表达-expression of rice notch protein in rice tooth leaf dwarf virus infection mode.docx

目录摘要IAbstractIII第一章文献综述11.1水稻锯齿叶矮缩病11.1.1水稻锯齿叶矮缩病的发生及危害11.1.2水稻锯齿叶矮缩病的病害症状11.1.3水稻锯齿叶矮缩病的防治对策21.1.4水稻锯齿叶矮缩病毒的分类地位31.1.5RRSV传毒介体和寄主范围31.2叶的形态发育研究进展31.2.1植物叶片卷叶、缺刻、分蘖的机制研究31.2.2参与植物生长发育相关的miRNA研究41.3启动子基因功能研究进展61.3.1启动子的概念和特征61.3.2启动子的结构特征71.3.3启动子的种类和功能71.3.4启动子克隆方法研究进展141.4缺刻蛋白基因的研究进展151.5本研究的立题依据和意义16第二章缺刻蛋白基因启动子的克隆与植物表达载体构建182.1材料182.1.1菌种与载体182.1.2主要试剂与仪器182.2方法182.2.1引物设计与合成182.3.2重组克隆载体的鉴定和分析242.4植物表达载体的构建和阳性克隆的测序鉴定252.4.1植物表达载体的构建252.4.2植物表达载体转化农杆菌272.4.3重组根癌农杆菌EHA105的菌液PCR鉴定282.5结果与分析282.5.1构建的三个SE基因启动子重组质粒的PCR鉴定和酶切鉴定282.5.2SE基因启动子的植物表达载体质粒转化农杆菌结果分析302.6小结与讨论30第三章转基因水稻中缺刻蛋白基因的表达量及其启动子组织定位分析323.1材料、试剂和仪器323.2研究方法323.2.1农杆菌介导的水稻遗传转化323.2.2转基因水稻的分子检测363.3结果与分析393.3.1转基因水稻的PCR鉴定结果393.3.2三个缺刻蛋白基因启动子转基因水稻中的组织定位分析403.3.3转基因水稻的表型分析423.3.4缺刻蛋白基因在转基因水稻中的表达量分析443.3.5转基因水稻中的GUS表达量分析483.4小结与讨论49第四章缺刻蛋白基因启动子在拟南芥中的组织定位分析514.1实验材料、菌种与试剂514.2实验方法514.2.1拟南芥植株的栽培514.2.2FloralDip法对拟南芥的遗传转化514.2.3拟南芥T1代植株的筛选培养524.2.4转基因拟南芥的DNA提取和PCR鉴定524.2.5转基因拟南芥的GUS染色524.3结果与分析534.3.1T1代转基因拟南芥的获得534.3.2转基因拟南芥的PCR鉴定结果534.3.3转基因拟南芥的GUS组织定位分析544.4小结56第五章缺刻蛋白的多克隆抗体制备及其效价检测575.1材料575.1.1材料、菌株与载体575.1.2实验试剂575.1.3实验兔575.2方法575.2.1水稻叶片总RNA的提取（同3.2.2.4.2）575.2.2引物设计575.2.3目的片段的克隆与纯化585.2.4Gateway重组技术构建原核表达载体585.2.5构建的目的载体对Rosetta表达菌株的转化595.2.6IPTG诱导蛋白的表达及可溶性分析605.2.7抗血清的制备60ELISA效价检测61Westernblot检测615.3结果615.3.1目的基因的扩增615.3.2BP重组构建表达载体的鉴定625.3.3LR重组构建表达载体的鉴定625.3.4缺刻蛋白的诱导表达和可溶性分析635.3.5抗血清ELISA效价检测以及Westernblot特异性检测655.4小结65第六章全文总结与讨论676.1转基因水稻的获得及分子检测676.2缺刻蛋白启动子基因在转基因水稻中的GUS组织定位分析676.3转基因水稻的表型分析686.4缺刻蛋白基因和GUS基因在转基因水稻中的表达量分析686.5缺刻蛋白基因启动子在转基因拟南芥中的组织定位分析696.6缺刻蛋白的多克隆抗体制备及其检测696.7讨论70参考文献73附录一：常用培养基的配制82附录二：转基因培养基的配制86附录三：westernblot及其他试剂的配制90致谢:90摘要水稻齿叶矮缩病是由褐飞虱（NilaparvataLugens）传播的病毒病，其病原是水稻锯齿叶矮缩病毒（Riceraggedstuntvirus,RRSV），最明显的症状表现为叶片卷缩、叶缘锯齿。有研究发现缺刻蛋白（serrateprotein,SEprotein）基因在调节植物叶片的发育中起着重要的作用，并且本实验室通过RT-PCR检测RRSV侵染后水稻体内缺刻蛋白基因的表达量，发现RRSV侵染后水稻中缺刻蛋白SE-1基因的表达量是明显上调，而SE-2、SE-3基因的表达量与健康水稻相比差异不明显。为了研究水稻中SE启动子的功能，本实验构建了SE启动子的植物表达载体。分别命名为Pro-SE-1、Pro-SE-2、Pro-SE-3。通过农杆菌介导的遗传转化法和FloralDip法分别将其转入日本晴水稻和拟南芥