稳定表达牛mx1蛋白bhk-21细胞株的构建及其抗口蹄疫病毒活性分析-construction of bhk - 21 cell line stably expressing bovine mx1 protein and analysis of its anti-foot-and-mouth disease virus activity.docxVIP

Establishment of BHK-21 Cell Line Stably Expressing Bovine Mx1 Protein and Its Anti-FMDV Activity A Dissertation Submitted to Shihezi University In Partial Fulfillment of the Requirements For the Degree of Master of Agriculture By Cai Kuo jun (Preventive Veterinary Medicine) Dissertation Supervisor: Prof. Qiao Jun June, 2013 课题来源 国家转基因生物新品种培育国家重大专项课题（项目编号：2009ZX08006-003B） 石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果.据我所知，除 文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果.对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意. 研究生签名:点却军 时间: ]/O/ 年/月 f 日 使用授权声明 本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主 管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版.有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅. 有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务.有权将学位论文的标题和摘要汇编 出版.保密的学位论文在解密后适用本规定. : n : n I .-日 导师签名 J二 亏 时问 年 !J 时问: :H/ 3 年 J 月 d 日 I I 中文摘要 Mx 蛋白是由 I 型干扰素诱导宿主细胞所产生的一种抗病毒蛋白质，该蛋白属于 GTP 酶活性的动态蛋白超家族成员之一。 Mx 蛋白具有广谱的抗病毒活性，目前已相继发现 了鼠、人、牛、羊、鱼等不同物种的 Mx 蛋白，并检测到其对流感病毒（Influenzavirus, IV）、水疱性口炎病毒（Vesicularstomatitisvirus ,VSV）、托高土病毒（Thogotovirus）及 乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus,HBV）等多种 RNA 病毒与少数 DNA 病毒增殖的抑制 作用。 口蹄疫病毒（Foot-and-mouthdiseasevirus, FMDV）是国际兽医局（OIE）规定的 A 类动物病原微生物之一，能引起偶蹄动物口蹄疫。该病具有高度传染和持续性感染的特 性，对偶蹄动物的健康和生产性能危害极大，严重威胁畜牧业的发展。研究发现， I 型 干扰素对多种病毒的复制具有较强的抑制作用，是脊椎动物抵抗病毒感染的一道重要防 线。已经有研究证明，I 型干扰素主要依赖其诱导的抗病毒蛋白 2，5-寡腺苷酸合成酶 （OAS-1）和蛋白激酶（PKR）对 FMDV 的复制产生抑制作用。Mx 蛋白是随后发现的 由 I 型干扰素诱导的第三种抗病毒蛋白，该蛋白在机体抗 FMDV 感染中的作用目前尚不 清楚。为了证实牛 Mx1 蛋白是否具有抗 FMDV 活性，本研究克隆了牛 Mx1 基因，将其 定向插入原核表达载体并在大肠杆菌中诱导表达，获得了重组牛 Mx1 融合蛋白，免疫 小鼠后制备了抗牛 Mx1 蛋白特异性抗体；构建了 pcDNA3.1/ bMx1 真核表达载体，将真 核表达载体转染 BHK-21 细胞，经过 G418 筛选，获得了稳定表达牛 Mx1 蛋白的重组 BHK-21 细胞株，并在该细胞株上检测了牛 Mx1 蛋白抗 FMDV 活性。研究方法和主要 结果如下： 1. 牛 Mx1 基因的克隆、原核表达及其抗体制备：采用 RT-PCR 方法从中国荷斯坦 奶牛外周血淋巴细胞总 RNA 中扩增出牛 Mx1 基因，扩增产物经 KpnI、XhoI 双酶切后 插入原核表达载体 pET-32a(+)中；对构建的重组质粒 pET-32a/bMx1 进行 PCR、酶切和 测序鉴定后，将其转化至工程菌 BL21(DE3)中，IPTG 诱导表达，表达产物用 SDS和蛋白免疫印迹（Western blot）分析；用 Ni 柱纯化融合蛋白，将纯化的蛋白加佐剂后 免疫小鼠，制备抗血清，琼扩试验检测抗体效价。结果成功克隆了牛 Mx1 基因编码区， 构建了牛 Mx1 基因原核表达载体 pET-32a/bMx1；转化后的 BL21(DE3)在 28℃、1.0 mmol/L IPTG 浓度条件下诱导 6 h 时，SDS分析发现在相对分子质量约 90 kDa 的 位置出现预期大小一致的蛋白条带，表达量占菌体总蛋白量的 28%；West