褪黑素对大鼠肝纤维化的保护作用及其对nf кb活性的影响-protective effect of melatonin on hepatic fibrosis in rats and its effect on nf с b activity.docx

安徽医科大学博士学位论文 安徽医科大学博士学位论文 5 5 的保护作用研究尚少。 核转录因子 кB（Nuclear factor-kappaB ，NF-кB）是由二聚体构成的转录因子 家族，具有调控炎症、免疫、创伤愈合、细胞生存、细胞功能等作用。生理应激、 氧化应激、暴露于某些化学品均可导致 NF-кB 激活，进而发挥其关键性的应激反 应调节作用。NF-кB 过度激活与许多疾病有关。近来 NF-кB 在肝脏疾病中的功能 和调控受到关注，肝脏的损伤和纤维增生涉及到 NF-кB 的活化。NF-кB 在肝纤维 化中的确切作用尚不甚清楚，褪黑素对纤维化肝脏中 NF-кB 活性的影响及其后果 未见系统研究。本课题在建立大鼠 CCl4 诱导的化学性肝纤维化模型基础上，探讨 MEL 对肝纤维化的抑制作用和可能机制。同时，探讨 NF-кB 在 CCl4 诱导的化学 性肝纤维化中的作用，以及 MEL 是否通过抑制 NF-кB 活性而发挥抗纤维化作用。 方法 采用四氯化碳（carbon tetrachloride ，CCl4）制备SD大鼠化学性肝纤维化模型。 所有大鼠随机分为6组：正常对照组（normal control group，normal组，11只）、模 型对照组（model control group, model组，20只）、CCl4＋N-乙酰－L-半胱氨酸组 （NAC组，为阳性药对照，20只）、CCl4＋低剂量褪黑素组（MEL1组，20只）、CCl4 ＋中剂量褪黑素组（MEL2组，20只）、CCl4＋高剂量褪黑素组（MEL3组，20只）。 将CCl4与精制花生油按2 ：3 比例配成40％CCl4油剂溶液，除正常对照组外，余按 3ml/kg给大鼠皮下注射，每周两次，连续12周，正常对照组注射等容量花生油作为 对照。自动物皮下注射CCl4之日起，开始给药， NAC 100 mg/kg, i.p.，每天1次； MEL低、中、高剂量组分别给予MEL 2.5 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg，均为腹腔注 射。12周实验结束后，所有动物予以麻醉，腹主动脉取血，取出肝脏并称湿重。 HE染色和Van Gieson (VG)胶原纤维染色观察肝脏病理改变；全自动生化分析仪检 测血清谷丙转氨酶（alanine aminotransferase， ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase ，AST）、白蛋白（albumin, A）、球蛋白(globulin, G )水平；生化 法测定肝脏羟脯氨酸 (hydroxyproline ,Hyp)、丙二醛 (malondialdehyde ,MDA)含量 和谷胱甘肽过氧化物酶活性(glutathione peroxidase ,GPx)；放射免疫法测定血清透 明质酸（hyaluronic acid,HA）、层粘连蛋白（laminin,LN）、三型前胶原氨端肽 6 6 （procollagen Ⅲ N-terminal peptide，PⅢNP）含量；免疫组化法测定肝组织中NF-кB P50、NF-кB P65、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、细胞间粘附 分子-1（Intercellular adhesion molecule-1，ICAM－1）的表达；RT-PCR法测定肝组 织中 Ⅰ 型前胶原（ procollagen typeⅠ ） mRNA 表达；电泳迁移率改变分析 （electrophoretic mobility shift assay ，EMSA）测定肝组织中NF-кB DNA结合活性； 同时，用原位灌注加密度梯度离心法分离正常SD大鼠肝脏星状细胞，以免疫组化 法鉴定（用desmin抗体），在培养的肝星状细胞中加入脂多糖（LPS）进行刺激， 用MTT法测定不同浓度的MEL对肝星状细胞增殖的抑制作用。 结果 1. MEL对大鼠化学性肝纤维化的保护作用 通过12周皮下注射CCl4，成功建立了大鼠肝纤维化模型。病理分级显示：正 常对照组和CCl4处理各组之间差异显著（P 0.01），和模型组相比，MEL(10 mg/kg) 组肝纤维化程度较轻，有统计学意义（P 0.05），表明MEL(10 mg/kg)有抑制肝纤 维化作用。与正常对照组比较，CCl4处理各组血清ALT、AST水平显著升高（P 0.01），与模型组比较，MEL(5, 10 mg/kg)能显著降低升高的的ALT、AST水平（P 0.05，P 0.01），NAC也能显著降低升高的ALT、AST水平（P 0.05），其作 用强度和MEL相近。同样，与模型组比较，MEL(10 mg/kg)能降低肝脏Hyp含量和 LN、HA水平，表明MEL对纤